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背景：
手足口病(Hand，foot and mouth disease，HFMD)是一种常见的急性传染病。该病常见于5岁以下婴幼儿，多数病例仅表现为轻症，部分病例可发展为重症HFMD，并伴有脑炎、脑膜炎、急性弛缓性麻痹(Acute flaccid paralysis， AFP)、神经源性肺水肿(Neurogenic pulmonary edema，NPE)及心肺衰竭等严重并发症甚至死亡。重症HFMD致死、致残率高，严重危害婴幼儿生命健康，已经成为一个严重的公共卫生问题，亟待研究解决。肠道病毒A71型(Enterovirus A71，EV-A71)是引起重症HFMD的主要病原体，研究EV-A71感染的致病机制对揭示重症HFMD的发病机制具有重要意义。重症HFMD患者常伴有血压升高，肾素-血管紧张素系统(Renin-angiotensin system，RAS)是人体重要的血压调控系统，且RAS已被证明参与多种急性传染性疾病的致病进程，例如重症急性呼吸综合征(Severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV)、新型冠状病毒肺炎(Coronavirus disease 2019，COVID-19)和禽流感等。与这些急性疾病类似，重症HFMD往往也伴随肺部炎症、充血乃至呼吸系统衰竭。为了探讨RAS是否参与HFMD重症化，本研究在人群流行病学基础上构建动物模型，旨在揭示RAS在HFMD重症化中的作用与可能的机制。
目的：
1.探讨RAS是否与重症HFMD的发病有关。
2.揭示RAS在HFMD重症化中的作用与机制。
方法：
1.采用病例对照研究设计，收集2013年4月至2013年6月在郑州市儿童医院住院的146名HFMD病例的临床资料及相关检查结果，根据临床诊断标准，将病例分为轻症组(n=91)和重症组(n=55)，以轻症组为对照组，以重症组为病例组。采集两组病例的人口学基本特征、临床体征、血常规及生化检验结果等临床资料。分析上述数据，探讨与重症HFMD发病相关的因素。
2.采用巢式序列病例对照研究设计，收集2015年6月至2015年8月在郑州市儿童医院住院的132名HFMD病例及30名健康儿童的血清；根据临床诊断标准，将132名HFMD病例分为轻症组(n=79)和重症组(n=53)，30名健康儿童为对照组。根据不同的发病时间(自出疹或发热始至入院采血的天数)将HFMD病例分为发病第1、2、3、4和5天等5个亚组，分别命名为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ。酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法检测RAS两个关键分子-血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)和去甲肾上腺素(Norepinephrine，NE)的血清浓度，探讨RAS是否与重症HFMD有关。
3.通过腹腔途径注射EV-A71构建HFMD动物模型，对照组小鼠注射等体积细胞培养上清，逐天观察小鼠感染EV-A71后的临床症状。分别在感染后不同时间处死小鼠，收集小鼠血清，测定炎症相关因子及RAS相关分子水平；取小鼠脑组织和肺组织进行病理学检查，qRT-PCR测定RAS相关基因mRNA表达量，揭示RAS是否参与HFMD重症化。
4.采用RAS抑制剂：血管紧张素Ⅱ1型受体阻滞剂(AngiotensinⅡtype1receptorblockers，ARBs)类药物厄贝沙坦及血管紧张素转化酶抑制剂(Angiotensin-converting-enzyme inhibitors，ACEI)类药物卡托普利，对EV-A71感染动物模型进行干预，逐天观察各组小鼠的临床症状。分别在感染后不同时间处死小鼠，收集小鼠血清，测定炎症相关因子水平；取小鼠脑组织和肺组织进行病理学检查，qRT-PCR测定炎症相关基因mRNA表达量，揭示RAS在HFMD重症化中的作用与机制。
结果：
1.重症组患者T淋巴细胞(T细胞，CD3+)、辅助性T细胞(Th细胞，CD3+CD4+)、Th细胞/Ts细胞(CD4/CD8)水平均低于轻症组，自然杀伤细胞(NK细胞，CD16+CD56+)、B淋巴细胞(CD19+)水平高于轻症组，差异均具有统计学意义(P<0.05)。重症组患者细胞毒性T细胞(CytotoxicTlymphocyte，CTL，CD3+CD8+)水平低于轻症组，差异无统计学意义(P>0.05)。重症组患者补体(Complement, C)3、C4、免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)A水平高于轻症组，差异均具有统计学意义(P<0.05)。重症组患者IgM和IgG水平高于轻症组，差异无统计学意义(P>0.05)。重症组患者的舒张压、收缩压、呼吸频率及异常呼吸(长叹气或双吸气)率均高于轻症组，差异具有统计学意义(P<0.05)。重症组患者脉搏高于轻症组，差异无统计学意义(P>0.05)。
2.HFMD患者(轻症或重症)血清AngⅡ和NE浓度均高于健康对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。重症组患者血清AngⅡ和NE浓度均高于轻症组，差异具有统计学意义(P<0.05)。重症组患者血清AngⅡ和NE浓度在发病第3天达到峰值。HFMD患者血清AngⅡ与NE浓度呈正相关(轻症组：r=0.492，P<0.001；重症组：r=0.645，P<0.001)。在发病后第1~5天，轻症组患者血清AngⅡ及NE浓度变化的差异无统计学意义，P>0.05。在发病后第1~5天，重症组患者血清AngⅡ浓度均高于轻症组，差异具有统计学意义(P<0.05)。发病后第2~4天，重症组患者血清NE水平均高于轻症组，P<0.05。重症组患者AngⅡ及NE的血清浓度均呈现出先升后降的趋势，均在发病后第3天达到峰值。
3.在感染后第1天(1 day post infection，1 dpi)至感染后5dpi，对照组小鼠脑组织和肺组织均未出现明显的病理学改变。在3dpi，EV-A71感染组小鼠脑组织出现病理学改变，病理评分差异具有统计学意义(P<0.05)。在3~5dpi，与对照组小鼠相比，EV-A71感染组小鼠肺组织出现病变，如肺泡腔扩大和红细胞渗漏，病理学评分差异具有统计学意义(P<0.05)。
在1~5dpi，与对照组小鼠相比，EV-A71感染组小鼠血清白介素(Interleukin，IL)-6、IL-10、AngⅡ、Ang(1-7)、血管紧张素转换酶(Angiotensin converting enzyme，ACE)、ACE2浓度升高，差异具有统计学意义，P<0.05。在1~3dpi，EV-A71感染组小鼠血清肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor，TNF)-α浓度高于对照组，差异具有统计学意义，P<0.05。在3dpi和5dpi，EV-A71感染组小鼠血清干扰素(Interferon，IFN)-γ浓度高于对照组，差异具有统计学意义，P<0.05。在3dpi和4dpi，EV-A71感染组小鼠血清AngⅡ与Ang(1-7)浓度的比值较对照组升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。
在1~5dpi，对照组小鼠脑组织和肺组织中血小板-内皮细胞粘附分子(Platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1/CD31)和血管紧张素Ⅱ1型受体(Angiotensin II Type 1 Receptor，AT1R)的平均光密度(Average optical density，AOD)改变的差异无统计学意义(P>0.05)。在1~5dpi，EV-A71感染组小鼠脑组织AT1R的AOD均高于对照组(P<0.05)，在3~5dpi，EV-A71感染组小鼠脑组织CD31的AOD均高于对照组(P<0.05)。在3~5dpi，EV-A71感染组小鼠肺组织AT1R和CD31的AOD均高于对照组(P<0.05)。在1~5dpi，EV-A71感染组小鼠脑组织中肾素(Renin)、血管紧张素原(Angiotensinogen， AGT)mRNA表达量高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。
在1~3dpi，EV-A71感染组小鼠脑组织中ACE、Mas受体(Mas Receptor， MasR)和血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)mRNA表达量高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。在1~5dpi，EV-A71感染组小鼠脑组织Renin、AGT、ACE、AT1R、MasR和VEGFmRNA表达量变化的差异具有统计学意义，P<0.05。在2dpi，EV-A71感染组小鼠肺组织中Renin、AGT、ACE和MasR的mRNA表达水平较1dpi下降(P<0.05)，3dpi升高至峰值(P<0.05)，4dpi下降(P<0.05)。在1~2dpi，EV-A71感染组小鼠肺组织AT1RmRNA表达量低于对照组(P<0.05)。在3~5dpi，EV-A71感染组小鼠肺组织中的AT1R和VEGFmRNA表达量持续上升(P<0.05)。
4.在3dpi采用RAS抑制剂ARBs(厄贝沙坦，30mg/kg.bw)和ACEI(卡托普利，90mg/kg.bw)干预EV-A71感染小鼠。与EV-A71组小鼠相比，ARBs和ACEI干预组小鼠脑组织和肺组织病理评分降低，脑组织和肺组织CD31和AT1R的AOD降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。在5dpi，ARBs干预组小鼠血清IL-6浓度低于EV-A71感染组和对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。ARBs和ACEI干预组小鼠血清IL-6、IL-10、IFN-γ较EV-A71感染组降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。在5dpi，ARBs和ACEI干预组小鼠脑组织和肺组织中IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ的mRNA表达量均低于EV-A71感染组，差异具有统计学意义(P<0.05)。ARBs和ACEI干预组小鼠脑组织IL-6的mRNA表达量均高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。ACEI干预组小鼠脑组织中TNF-α的mRNA表达量高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。ARBs和ACEI干预组小鼠肺组织中IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ的mRNA表达量均高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。
结论：
1.血压升高与重症HFMD有关，RAS激活参与HFMD的重症化。
2.EV-A71感染可激活小鼠RAS，RAS抑制剂干预可以减少组织病变，降低炎症反应，有效阻断EV-A71感染小鼠HFMD重症化。
手足口病(Hand，foot and mouth disease，HFMD)是一种常见的急性传染病。该病常见于5岁以下婴幼儿，多数病例仅表现为轻症，部分病例可发展为重症HFMD，并伴有脑炎、脑膜炎、急性弛缓性麻痹(Acute flaccid paralysis， AFP)、神经源性肺水肿(Neurogenic pulmonary edema，NPE)及心肺衰竭等严重并发症甚至死亡。重症HFMD致死、致残率高，严重危害婴幼儿生命健康，已经成为一个严重的公共卫生问题，亟待研究解决。肠道病毒A71型(Enterovirus A71，EV-A71)是引起重症HFMD的主要病原体，研究EV-A71感染的致病机制对揭示重症HFMD的发病机制具有重要意义。重症HFMD患者常伴有血压升高，肾素-血管紧张素系统(Renin-angiotensin system，RAS)是人体重要的血压调控系统，且RAS已被证明参与多种急性传染性疾病的致病进程，例如重症急性呼吸综合征(Severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV)、新型冠状病毒肺炎(Coronavirus disease 2019，COVID-19)和禽流感等。与这些急性疾病类似，重症HFMD往往也伴随肺部炎症、充血乃至呼吸系统衰竭。为了探讨RAS是否参与HFMD重症化，本研究在人群流行病学基础上构建动物模型，旨在揭示RAS在HFMD重症化中的作用与可能的机制。
目的：
1.探讨RAS是否与重症HFMD的发病有关。
2.揭示RAS在HFMD重症化中的作用与机制。
方法：
1.采用病例对照研究设计，收集2013年4月至2013年6月在郑州市儿童医院住院的146名HFMD病例的临床资料及相关检查结果，根据临床诊断标准，将病例分为轻症组(n=91)和重症组(n=55)，以轻症组为对照组，以重症组为病例组。采集两组病例的人口学基本特征、临床体征、血常规及生化检验结果等临床资料。分析上述数据，探讨与重症HFMD发病相关的因素。
2.采用巢式序列病例对照研究设计，收集2015年6月至2015年8月在郑州市儿童医院住院的132名HFMD病例及30名健康儿童的血清；根据临床诊断标准，将132名HFMD病例分为轻症组(n=79)和重症组(n=53)，30名健康儿童为对照组。根据不同的发病时间(自出疹或发热始至入院采血的天数)将HFMD病例分为发病第1、2、3、4和5天等5个亚组，分别命名为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ。酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法检测RAS两个关键分子-血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)和去甲肾上腺素(Norepinephrine，NE)的血清浓度，探讨RAS是否与重症HFMD有关。
3.通过腹腔途径注射EV-A71构建HFMD动物模型，对照组小鼠注射等体积细胞培养上清，逐天观察小鼠感染EV-A71后的临床症状。分别在感染后不同时间处死小鼠，收集小鼠血清，测定炎症相关因子及RAS相关分子水平；取小鼠脑组织和肺组织进行病理学检查，qRT-PCR测定RAS相关基因mRNA表达量，揭示RAS是否参与HFMD重症化。
4.采用RAS抑制剂：血管紧张素Ⅱ1型受体阻滞剂(AngiotensinⅡtype1receptorblockers，ARBs)类药物厄贝沙坦及血管紧张素转化酶抑制剂(Angiotensin-converting-enzyme inhibitors，ACEI)类药物卡托普利，对EV-A71感染动物模型进行干预，逐天观察各组小鼠的临床症状。分别在感染后不同时间处死小鼠，收集小鼠血清，测定炎症相关因子水平；取小鼠脑组织和肺组织进行病理学检查，qRT-PCR测定炎症相关基因mRNA表达量，揭示RAS在HFMD重症化中的作用与机制。
结果：
1.重症组患者T淋巴细胞(T细胞，CD3+)、辅助性T细胞(Th细胞，CD3+CD4+)、Th细胞/Ts细胞(CD4/CD8)水平均低于轻症组，自然杀伤细胞(NK细胞，CD16+CD56+)、B淋巴细胞(CD19+)水平高于轻症组，差异均具有统计学意义(P<0.05)。重症组患者细胞毒性T细胞(CytotoxicTlymphocyte，CTL，CD3+CD8+)水平低于轻症组，差异无统计学意义(P>0.05)。重症组患者补体(Complement, C)3、C4、免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)A水平高于轻症组，差异均具有统计学意义(P<0.05)。重症组患者IgM和IgG水平高于轻症组，差异无统计学意义(P>0.05)。重症组患者的舒张压、收缩压、呼吸频率及异常呼吸(长叹气或双吸气)率均高于轻症组，差异具有统计学意义(P<0.05)。重症组患者脉搏高于轻症组，差异无统计学意义(P>0.05)。
2.HFMD患者(轻症或重症)血清AngⅡ和NE浓度均高于健康对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。重症组患者血清AngⅡ和NE浓度均高于轻症组，差异具有统计学意义(P<0.05)。重症组患者血清AngⅡ和NE浓度在发病第3天达到峰值。HFMD患者血清AngⅡ与NE浓度呈正相关(轻症组：r=0.492，P<0.001；重症组：r=0.645，P<0.001)。在发病后第1~5天，轻症组患者血清AngⅡ及NE浓度变化的差异无统计学意义，P>0.05。在发病后第1~5天，重症组患者血清AngⅡ浓度均高于轻症组，差异具有统计学意义(P<0.05)。发病后第2~4天，重症组患者血清NE水平均高于轻症组，P<0.05。重症组患者AngⅡ及NE的血清浓度均呈现出先升后降的趋势，均在发病后第3天达到峰值。
3.在感染后第1天(1 day post infection，1 dpi)至感染后5dpi，对照组小鼠脑组织和肺组织均未出现明显的病理学改变。在3dpi，EV-A71感染组小鼠脑组织出现病理学改变，病理评分差异具有统计学意义(P<0.05)。在3~5dpi，与对照组小鼠相比，EV-A71感染组小鼠肺组织出现病变，如肺泡腔扩大和红细胞渗漏，病理学评分差异具有统计学意义(P<0.05)。
在1~5dpi，与对照组小鼠相比，EV-A71感染组小鼠血清白介素(Interleukin，IL)-6、IL-10、AngⅡ、Ang(1-7)、血管紧张素转换酶(Angiotensin converting enzyme，ACE)、ACE2浓度升高，差异具有统计学意义，P<0.05。在1~3dpi，EV-A71感染组小鼠血清肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor，TNF)-α浓度高于对照组，差异具有统计学意义，P<0.05。在3dpi和5dpi，EV-A71感染组小鼠血清干扰素(Interferon，IFN)-γ浓度高于对照组，差异具有统计学意义，P<0.05。在3dpi和4dpi，EV-A71感染组小鼠血清AngⅡ与Ang(1-7)浓度的比值较对照组升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。
在1~5dpi，对照组小鼠脑组织和肺组织中血小板-内皮细胞粘附分子(Platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1/CD31)和血管紧张素Ⅱ1型受体(Angiotensin II Type 1 Receptor，AT1R)的平均光密度(Average optical density，AOD)改变的差异无统计学意义(P>0.05)。在1~5dpi，EV-A71感染组小鼠脑组织AT1R的AOD均高于对照组(P<0.05)，在3~5dpi，EV-A71感染组小鼠脑组织CD31的AOD均高于对照组(P<0.05)。在3~5dpi，EV-A71感染组小鼠肺组织AT1R和CD31的AOD均高于对照组(P<0.05)。在1~5dpi，EV-A71感染组小鼠脑组织中肾素(Renin)、血管紧张素原(Angiotensinogen， AGT)mRNA表达量高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。
在1~3dpi，EV-A71感染组小鼠脑组织中ACE、Mas受体(Mas Receptor， MasR)和血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)mRNA表达量高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。在1~5dpi，EV-A71感染组小鼠脑组织Renin、AGT、ACE、AT1R、MasR和VEGFmRNA表达量变化的差异具有统计学意义，P<0.05。在2dpi，EV-A71感染组小鼠肺组织中Renin、AGT、ACE和MasR的mRNA表达水平较1dpi下降(P<0.05)，3dpi升高至峰值(P<0.05)，4dpi下降(P<0.05)。在1~2dpi，EV-A71感染组小鼠肺组织AT1RmRNA表达量低于对照组(P<0.05)。在3~5dpi，EV-A71感染组小鼠肺组织中的AT1R和VEGFmRNA表达量持续上升(P<0.05)。
4.在3dpi采用RAS抑制剂ARBs(厄贝沙坦，30mg/kg.bw)和ACEI(卡托普利，90mg/kg.bw)干预EV-A71感染小鼠。与EV-A71组小鼠相比，ARBs和ACEI干预组小鼠脑组织和肺组织病理评分降低，脑组织和肺组织CD31和AT1R的AOD降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。在5dpi，ARBs干预组小鼠血清IL-6浓度低于EV-A71感染组和对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。ARBs和ACEI干预组小鼠血清IL-6、IL-10、IFN-γ较EV-A71感染组降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。在5dpi，ARBs和ACEI干预组小鼠脑组织和肺组织中IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ的mRNA表达量均低于EV-A71感染组，差异具有统计学意义(P<0.05)。ARBs和ACEI干预组小鼠脑组织IL-6的mRNA表达量均高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。ACEI干预组小鼠脑组织中TNF-α的mRNA表达量高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。ARBs和ACEI干预组小鼠肺组织中IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ的mRNA表达量均高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。
结论：
1.血压升高与重症HFMD有关，RAS激活参与HFMD的重症化。
2.EV-A71感染可激活小鼠RAS，RAS抑制剂干预可以减少组织病变，降低炎症反应，有效阻断EV-A71感染小鼠HFMD重症化。