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研究背景
大气细颗粒物(fine particulate matter, PM2.5)是指悬浮于空气中空气动力学直径≤2.5μm的固态或液态颗粒物。PM2.5对人体呼吸系统、心血管系统、免疫系统及神经系统等均能产生损害作用。研究显示，PM2.5暴露与生殖功能损伤关系密切，但其造成损伤的机制仍未被阐明。核转录因子κB(NucleartransportationfactorκB，NF-κB)是一种广泛表达的炎症调节转录因子，自噬可调控很多重要的生理过程。NF-κB和自噬作为参与调节炎症反应的重要因子，二者关系密切。然而，NF-κB和自噬是否参与PM2.5导致的生殖损伤，尚未见报道。因此本文针对PM2.5致生殖损伤中NF-κB和自噬的作用机制进行探讨。
目的
本研究拟通过体内动物实验和体外细胞实验相结合的方法，探讨NF-κB信号通路介导的自噬在PM2.5致生殖损伤中的作用。
方法
1.使用大流量采样器采集PM2.5，石英纤维滤膜采样。分析质量浓度，并采用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)检测其中的9种金属元素的含量。
2.实验动物选择及分组
四周龄健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠60只，分为对照组、PDTC组、PM2.5组、PM2.5+PDTC组，染毒时间为4周。
3.PM2.5致雄性生殖损伤器官重量及损伤相关指标测定
分离睾丸和附睾组织称重，计算脏器系数和精子质量参数。酶联免疫法(ELISA)检测血清卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、睾酮(T)含量；HE染色观察睾丸组织病理学改变；TUNEL和荧光定量PCR(Real-time PCR， RT-PCR)法检测睾丸组织细胞凋亡水平；生化分析法检测睾丸组织氧化应激相关指标。
4.大鼠脏器中金属元素的检测
采用ICP-MS测定各组大鼠肺、血液、心脏和睾丸组织中金属元素。
5.原代细胞分离培养并确定PM2.5染毒浓度
三周龄雄性SD大鼠，对睾丸支持细胞进行分离、培养、纯化及鉴定。CCK-8检测不同剂量PM2.5染毒后细胞活性，结合IC50确定后续染毒剂量及时间。
6.NF-κB信号通路相关效应分子检测
分组为对照组、PDTC组、PM2.5组和PM2.5+PDTC组。RT-PCR和Westernblot技术检测NF-κB和炎性反应因子水平。
7.自噬诱导剂雷帕霉素(Rapamycin)、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)处理后，检测细胞增殖、凋亡及周期水平变化。
8.自噬反应状态的检测
透射电镜检测自噬体；RT-PCR和Westernblot检测自噬相关标志物的表达情况。
结果
1.各月份PM2.5浓度均超过环境空气质量限值。PM2.5中Cr、As元素超过其空气环境目标值。
2.与对照组相比，PM2.5组的大鼠体重(F=1.75,P=0.045)、睾丸重量(F=3.96,P=0.038)和附睾重量(F=4.52,P=0.018)均降低。大鼠的精子密度(F=10.66,P=0.022)和存活率(F=14.98,P=0.012)均明显降低，畸形率(F=21.25,P=0.006)显著升高。
3.睾丸组织HE染色的镜检结果显示，对照组和PDTC组的睾丸结构完整；PM2.5组的生精上皮细胞间结构松散，管腔内有脱落的生精上皮细胞；与PDTC联合作用后，管腔内脱落细胞明显减少。
4.与对照组相比，PM2.5组细胞凋亡率显著升高，差异有统计学意义(t=5.75,P=0.029)；与PM2.5组相比，PDTC联合作用组细胞凋亡水平降低，差异有统计学意义(t=4.88,P=0.040)。
5.卵泡刺激素：与对照组相比，PDTC组(t=6.23,P<0.001)、PM2.5组(t=6.72,P<0.001)和PM2.5+PDTC组的卵泡刺激素含量均降低(t=8.02,P<0.001)。黄体生成素：与对照组相比，PDTC组、PM2.5组、PM2.5+PDTC组的血清黄体生成素含量无明显变化。睾酮：与对照组相比，PM2.5组睾酮含量降低(t=6.86,P<0.001)。与PM2.5组相比，PDTC联合作用组的睾酮含量升高(t=4.39,P<0.001)。
6.睾丸组织中氧化应激指标的表达情况：PM2.5暴露促进MDA的表达水平，降低了SOD和GSH-Px的活力；加用PDTC后能降低MDA的表达水平(F=24.14,P=0.000)，而SOD(F=47.28,P=0.000)和GSH-Px(F=15.13,P=0.001)的活力有所上升。睾丸细胞中氧化应激指标的表达情况：25μg/ml和50μg/mlPM2.5组的MDA和SOD水平与对照组无明显差异，而100μg/ml、200μg/ml和400μg/mlPM2.5处理后，MDA水平显著升高，SOD水平降低。
7.睾丸组织和支持细胞NF-κB和炎症相关标志mRNA及蛋白表达情况，结果显示，NF-κB信号通路和下游炎症相关效应分子表达水平均升高，PDTC能有效拮抗NF-κB信号通路的活化，减轻炎症反应，差异有统计学意义(P<0.05)。
8.睾丸组织和支持细胞自噬相关标志mRNA及蛋白表达情况，结果显示，PM2.5处理显著上调了Beclinl、P62及LC3的表达水平，而PDTC能有效拮抗细胞自噬反应，差异有统计学意义(P<0.05)。透射电镜检测自噬体得到相同的结果。
9.检测大鼠肺、血液、心脏和睾丸中金属元素的含量发现，相对于对照组，PM2.5组肺组织中7种金属含量升高，血液中6种金属元素含量的升高，睾丸及心脏中4种金属元素升高。对于PM2.5暴露加用PDTC后，肺内Mg、Cu、Cd、Pb的含量降低；血液内Mg、Mn、Cd、Pb的含量降低；心脏内Cr、As、Cd的含量降低；睾丸内Cr、As、Cd的含量降低。
10.PM2.5处理组的睾丸支持细胞存活率下降、细胞增殖受抑制，差异有统计学意义(t=4.25,P<0.05)。
11.Rapamycin加重了PM2.5对细胞增殖的抑制作用(t=3.54,P=0.005)，促进细胞凋亡(t=4.54,P=0.045)；3-MA则减轻了PM2.5对细胞增殖的抑制作用(t=2.80,P=0.019)，抑制细胞凋亡(t=10.59,P=0.009)。PM2.5染毒后可引起S期阻滞，联合Rapamycin处理后S期阻滞更明显(t=4.21,P=0.042)；而联合3-MA处理则比PM2.5组S期细胞百分比要低(t=3.84,P=0.045)。
结论
1.在动物体内、体外不同层面，PM2.5对雄性生殖功能均具有显著的损伤效应。
2.PM2.5暴露可诱导氧化应激，激活NF-κB信号通路，并进一步引起炎症反应，同时激活自噬程序。
3.NF-κB信号通路介导活化的自噬反应进一步激活细胞凋亡、抑制细胞增殖并引起细胞周期阻滞，最终导致组织细胞损伤。
4.PM2.5中重金属元素Cr、As、Cd可能与其造成的雄性生殖功能损伤密切相关。
大气细颗粒物(fine particulate matter, PM2.5)是指悬浮于空气中空气动力学直径≤2.5μm的固态或液态颗粒物。PM2.5对人体呼吸系统、心血管系统、免疫系统及神经系统等均能产生损害作用。研究显示，PM2.5暴露与生殖功能损伤关系密切，但其造成损伤的机制仍未被阐明。核转录因子κB(NucleartransportationfactorκB，NF-κB)是一种广泛表达的炎症调节转录因子，自噬可调控很多重要的生理过程。NF-κB和自噬作为参与调节炎症反应的重要因子，二者关系密切。然而，NF-κB和自噬是否参与PM2.5导致的生殖损伤，尚未见报道。因此本文针对PM2.5致生殖损伤中NF-κB和自噬的作用机制进行探讨。
目的
本研究拟通过体内动物实验和体外细胞实验相结合的方法，探讨NF-κB信号通路介导的自噬在PM2.5致生殖损伤中的作用。
方法
1.使用大流量采样器采集PM2.5，石英纤维滤膜采样。分析质量浓度，并采用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)检测其中的9种金属元素的含量。
2.实验动物选择及分组
四周龄健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠60只，分为对照组、PDTC组、PM2.5组、PM2.5+PDTC组，染毒时间为4周。
3.PM2.5致雄性生殖损伤器官重量及损伤相关指标测定
分离睾丸和附睾组织称重，计算脏器系数和精子质量参数。酶联免疫法(ELISA)检测血清卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、睾酮(T)含量；HE染色观察睾丸组织病理学改变；TUNEL和荧光定量PCR(Real-time PCR， RT-PCR)法检测睾丸组织细胞凋亡水平；生化分析法检测睾丸组织氧化应激相关指标。
4.大鼠脏器中金属元素的检测
采用ICP-MS测定各组大鼠肺、血液、心脏和睾丸组织中金属元素。
5.原代细胞分离培养并确定PM2.5染毒浓度
三周龄雄性SD大鼠，对睾丸支持细胞进行分离、培养、纯化及鉴定。CCK-8检测不同剂量PM2.5染毒后细胞活性，结合IC50确定后续染毒剂量及时间。
6.NF-κB信号通路相关效应分子检测
分组为对照组、PDTC组、PM2.5组和PM2.5+PDTC组。RT-PCR和Westernblot技术检测NF-κB和炎性反应因子水平。
7.自噬诱导剂雷帕霉素(Rapamycin)、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)处理后，检测细胞增殖、凋亡及周期水平变化。
8.自噬反应状态的检测
透射电镜检测自噬体；RT-PCR和Westernblot检测自噬相关标志物的表达情况。
结果
1.各月份PM2.5浓度均超过环境空气质量限值。PM2.5中Cr、As元素超过其空气环境目标值。
2.与对照组相比，PM2.5组的大鼠体重(F=1.75,P=0.045)、睾丸重量(F=3.96,P=0.038)和附睾重量(F=4.52,P=0.018)均降低。大鼠的精子密度(F=10.66,P=0.022)和存活率(F=14.98,P=0.012)均明显降低，畸形率(F=21.25,P=0.006)显著升高。
3.睾丸组织HE染色的镜检结果显示，对照组和PDTC组的睾丸结构完整；PM2.5组的生精上皮细胞间结构松散，管腔内有脱落的生精上皮细胞；与PDTC联合作用后，管腔内脱落细胞明显减少。
4.与对照组相比，PM2.5组细胞凋亡率显著升高，差异有统计学意义(t=5.75,P=0.029)；与PM2.5组相比，PDTC联合作用组细胞凋亡水平降低，差异有统计学意义(t=4.88,P=0.040)。
5.卵泡刺激素：与对照组相比，PDTC组(t=6.23,P<0.001)、PM2.5组(t=6.72,P<0.001)和PM2.5+PDTC组的卵泡刺激素含量均降低(t=8.02,P<0.001)。黄体生成素：与对照组相比，PDTC组、PM2.5组、PM2.5+PDTC组的血清黄体生成素含量无明显变化。睾酮：与对照组相比，PM2.5组睾酮含量降低(t=6.86,P<0.001)。与PM2.5组相比，PDTC联合作用组的睾酮含量升高(t=4.39,P<0.001)。
6.睾丸组织中氧化应激指标的表达情况：PM2.5暴露促进MDA的表达水平，降低了SOD和GSH-Px的活力；加用PDTC后能降低MDA的表达水平(F=24.14,P=0.000)，而SOD(F=47.28,P=0.000)和GSH-Px(F=15.13,P=0.001)的活力有所上升。睾丸细胞中氧化应激指标的表达情况：25μg/ml和50μg/mlPM2.5组的MDA和SOD水平与对照组无明显差异，而100μg/ml、200μg/ml和400μg/mlPM2.5处理后，MDA水平显著升高，SOD水平降低。
7.睾丸组织和支持细胞NF-κB和炎症相关标志mRNA及蛋白表达情况，结果显示，NF-κB信号通路和下游炎症相关效应分子表达水平均升高，PDTC能有效拮抗NF-κB信号通路的活化，减轻炎症反应，差异有统计学意义(P<0.05)。
8.睾丸组织和支持细胞自噬相关标志mRNA及蛋白表达情况，结果显示，PM2.5处理显著上调了Beclinl、P62及LC3的表达水平，而PDTC能有效拮抗细胞自噬反应，差异有统计学意义(P<0.05)。透射电镜检测自噬体得到相同的结果。
9.检测大鼠肺、血液、心脏和睾丸中金属元素的含量发现，相对于对照组，PM2.5组肺组织中7种金属含量升高，血液中6种金属元素含量的升高，睾丸及心脏中4种金属元素升高。对于PM2.5暴露加用PDTC后，肺内Mg、Cu、Cd、Pb的含量降低；血液内Mg、Mn、Cd、Pb的含量降低；心脏内Cr、As、Cd的含量降低；睾丸内Cr、As、Cd的含量降低。
10.PM2.5处理组的睾丸支持细胞存活率下降、细胞增殖受抑制，差异有统计学意义(t=4.25,P<0.05)。
11.Rapamycin加重了PM2.5对细胞增殖的抑制作用(t=3.54,P=0.005)，促进细胞凋亡(t=4.54,P=0.045)；3-MA则减轻了PM2.5对细胞增殖的抑制作用(t=2.80,P=0.019)，抑制细胞凋亡(t=10.59,P=0.009)。PM2.5染毒后可引起S期阻滞，联合Rapamycin处理后S期阻滞更明显(t=4.21,P=0.042)；而联合3-MA处理则比PM2.5组S期细胞百分比要低(t=3.84,P=0.045)。
结论
1.在动物体内、体外不同层面，PM2.5对雄性生殖功能均具有显著的损伤效应。
2.PM2.5暴露可诱导氧化应激，激活NF-κB信号通路，并进一步引起炎症反应，同时激活自噬程序。
3.NF-κB信号通路介导活化的自噬反应进一步激活细胞凋亡、抑制细胞增殖并引起细胞周期阻滞，最终导致组织细胞损伤。
4.PM2.5中重金属元素Cr、As、Cd可能与其造成的雄性生殖功能损伤密切相关。