MicroRNA是一类进化上保守的、在转录后起着重要调控作用的约21 nt内源非编码RNA，且可广泛作用于植物的生长、发育以及应对胁迫的适应性生长。研究表明水稻内miRNA的表达可受稻瘟病菌的诱导，但是对与miRNA调控相关的抗病机制知之甚少。因此，稻瘟病菌诱导的miRNA表达分析可进一步完善水稻应答稻瘟病菌胁迫的分子调控机制，并为miRNA作为调控因子应用于水稻抗病育种提供研究基础。　　本研究以稻瘟病菌诱导或对照处理的水稻文库的small RNA高通量测序为基础，对一广谱、高抗稻瘟病水稻品系H4及感稻瘟病对照品种中二软占开展稻瘟病菌胁迫诱导相关的miRNA表达分析及功能研究，结果如下：　　(1)4个测序文库均可获得大量的small RNA序列，主要以21 nt、24 nt为主。经病原菌诱导后，small RNA组成在感病品种中较抗病品系表现更大差异，A(对照处理中二软占)、C(病原菌诱导中二软占)文库间仅共有64782(2.72％)small RNA序列，而B(对照处理H4)、D(病原菌诱导H4)文库间则具有123609(11.94％)的共同的序列；已知miRNA的表达组成差异也与此类似。Small RNA或miRNA应与水稻抗稻瘟病防卫反应相关，且它们的稳定表达与稻瘟病抗性具有一定的关系。　　(2)已知miRNA表达谱的主成分分析表明，第一主成分主要表现在对照处理的中二软占文库与其他3个文库间的表达差异，其贡献率达83.7％。经聚类分析，miRNA的表达谱可聚成5类，其中Ⅰ类、Ⅴ类的靶基因与应对病原菌胁迫较为相关。　　(3)在测序文库中，鉴定获得50个novel miRNA；经miRNA的基因组来源、二级结构及同源性分析等，多数novel miRNA是较为可靠的miRNA序列，且是水稻特异的非保守的miRNA。此外，7个23 nt的small RNA可被注释为novel miRNA。　　(4)MicroRNA的靶基因预测结果表明，432个基因可预测为其中46个novel miRNA的靶基因，且靶基因主要与应对干扰、胁迫的防卫途径相关；它们的功能和与病原菌诱导相关的4087个DEGs或与品种间差异表达相关的717个DEGs功能类似。50个novelmiRNA均可在其上游序列中预测得到与真菌防卫或特异激素的应激反应等相关的启动子元件；其中miRNA T46前体上游2 Kb区域内同时存在启动子元件TATAbox及与高转录水平相关的5’UTR Py-rich stretch元件，并成功构建以miRNA T46前体的上游2Kb序列为启动子的GUS表达载体。Novel miRNA应是与应答稻瘟病菌胁迫的分子调控机制相关的特异miRNA。　　(5)qRT-PCR验证实验确定9个novel miRNA的真实存在；在接种稻瘟病菌后48 h内，它们在抗病品系和感病品种中表现相似的动态表达模式；而在接种后48-72 h内，多数miRNA的表达模式在抗、感材料间出现明显差异。miRNA T4、T25、T32和T46多在0-12 h时表达水平上升但在12-24 h内则表现下降，而其余miRNA在该时段内则是多表现单一的上升或下降模式；同时，T4、T25、T32、T46和T51的靶基因的表达差异主要体现在抗、感材料间，其余miRNA的靶基因的表达差异则主要为病原菌诱导产生的。T4、T32的前体可比对上稻瘟病菌诱导后24 h的EST序列，且均靶向受体蛋白激酶，其中T4的靶基因LOC_Os11g47300位于一富含受体蛋白激酶的基因区域，该区域内分布着同样编码受体蛋白激酶MRKb的抗白叶枯病基因Xa26；而前体位于CACTA转座子上的T46的靶基因是一个位于前期抗病基因定位的区间内的RGALOC_Os11g46210。T4、T46的前体基因表达分析也表明它们经病原菌诱导后均可表现显著差异，且它们的表达模式与成熟体的表达模式在一定程度上是一致的。　　(6)在H4中，利用5’RACE实验验证miRNA T46可有效剪切比对上LOC_Os11g46210的EST、CB627915，且在该基因位点上可发现数量较多的small RNA序列，其中部分序列是双向转录的；并将该EST CB627915序列比对上与之高度同源的PiKm基因，设计保守引物可在H4中扩增得到其等位基因PiK-H4。PiK-H4基因由两紧密连锁的典型NBS-LRR结构域基因组成，PiK1-H4和PiK2-H4，它们的ORF序列分别为6350 bp和3230 bp：PiK1-H4和PiK2-H4在接种后不同时间段内具有类似的表达模式，且PiK2-H4的表达模式与T46具有一定的相关性。　　(7)PiK1-H4由3个外显子和2个内含子组成，CDS为3429 bp，编码1142个氨基酸；PiK2-H4由2个外显子和1个内含子组成，CDS为3066 bp，编码1021个氨基酸。PiK2-H4和其他PiK等位基因较为保守，等位基因间多态性则多存在于PiK1等位基因上；PiK-H4与PiK、PiKs、PiKm、PiKh具有不同程度的碱基差异，且PiK-H4与PiK、PiKs、PiKm、PiKh具有较大遗传距离，但与PiKp遗传距离较小，可由dCaps分子标记检测、区分。PiK1-H4与PiKp1-K60的氨基酸序列同源性达99％，PiK2-H4与PiKp2-K60的同源性则达100％；但H4与PiKp单基因系等对于菌株GD0193等的抗性反应不同，表明PiK-H4可能为一新的PiK位点等位基因。　　(8)过量表达miRNA的转基因植株的稻瘟病抗性分析结果表明，miRNA T46、T4在稻瘟病抗性分子机制中具有不同的调控作用。Ubi：T46 H4 T0代转化株的稻瘟病抗性较野生型显著降低，石狩白毛T1代株系的部分植株的稻瘟病抗性水平较阴性转化植株(CK)也有所下降，表明miRNA T46是R基因介导的抗稻瘟病反应途径的负向调控因子。另一方面，多个Ubi：T4石狩白毛T1代株系的稻瘟病抗性较CK则具有一定程度的提高，且存在明显的抗性分离，表明miRNA T4在水稻的稻瘟病抗性分子机制中具有正向的调控作用；然而，T4对水稻的白叶枯病抗病反应可能具有一定的负向调控作用，Ubi：T4日本晴转化株在接种白叶枯病Ⅳ型菌后，抗性反应中形成的褐变过敏性病斑较CK显著减少。此外，miRNA T46、T4对水稻的农艺性状表型也具有一定的负向调控作用，如粒型、穗长、穗数等。