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不良的环境因子如干旱、盐碱和低温等严重影响着农作物的正常生长发育和产量,同时也限制着作物的种植范围。植物通过长期进化,在其生长习性、结构、生理生化等方面形成了对逆境的各种适应对策。在抗逆性强的植物中分离相关抗逆性基因是作物抗逆性基因工程中的重要手段。以黄花苜蓿MfGol的已知氨基酸序列在GenBank中进行搜索,得到一个编码肌醇半乳糖苷合成酶基因(MfGol),含有完整编码框的序列,构建了pZY101-MfGol过量表达载体,应用农杆菌介导的大豆子叶节转化系统对MfGol基因进行遗传转化,在大豆中成功表达,获得了MfGol转基因大豆。主要研究结果如下: 利用生物信息学软件及方法,对MfGol序列的结构及蛋白的功能进行了生物信息学分析。设计特异引物,以逆境诱导处理的黄花苜蓿cDNA为模版,通过RT-PCR技术克隆得到MfGol基因。利用BamHI和KpnI位点将目的基因连接到中间载体pUC18-pZY102中间载体上。随后利用HindIII酶切位点将目的基因连接到双元载体pZY101上,形成pZY101-MfGol过量表达载体,并通过热击转化方法转化农杆菌株EHA101。 以华春3号、华春5号和华夏3号为受体材料,采用农杆菌介导大豆子叶节的遗传转化方法成功地将MfGol基因转入大豆植株。采用除草剂涂抹筛选、PCR技术对各个世代进行鉴定,并用RT-PCR技术检测MfGol基因在受体材料中的表达。 为了研究转基因大豆对盐胁迫的响应,我们利用MfGol转基因T2代大豆株系及其受体材料进行盐胁迫处理及其它生理指标的测定。研究结果表明,在200、250 mMNaCl浓度处理的条件下,与野生型相比,转基因株系L2、L4分别比野生型华春5号、华春3号耐盐。盐害指数、丙二醛及游离脯氨酸含量测定的结果进一步支持了上述结论,即MfGol基因显著提高了转基因大豆的耐盐性。 为了研究MfGol基因提高转基因大豆耐盐性的生理机制,我们采用高效液相色谱法测定了转基因植物及其受体材料中的可溶性总糖及棉籽糖含量。测定结果表明,在盐胁迫条件下,大豆叶片的可溶性总糖含量呈上调趋势,而转基因株系L2、L4的糖含量上调强度分别大于野生型植株华春5号和华春3号,其差异达到显著性。在盐胁迫处理后,转基因株系L2、L4,野生型华春5号、华春3号的棉籽糖含量均呈上调趋势。在200 mM NaCl处理的条件下,转基因株系L2棉籽糖含量是野生型华春5号的1.74倍,转基因株系L4棉籽糖含量是野生型华春3号的1.33倍;在250 mM NaCl处理的条件下,转基因株系L2棉籽糖含量是野生型华春5号的1.85倍,转基因株系L4棉籽糖含量是野生型华春3号的2.55倍。测定结果表明,MfGol可以促使大豆合成更多的可溶性糖特别是棉籽糖来增强植物抵抗盐胁迫的能力。