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天然β-胡萝卜素对人体健康有重要的作用,特别是含有化学合成品所缺乏的顺式异构体,人工合成品是纯单一的同种物质,而天然产品中含有相当比例的顺反异构体,它们在体内协同作用,从而具有一定的的生物学功能,顺式异构体己被证明在抗氧化和预防心血管疾病等方面具有较强的功能。β-胡萝卜素和含β-环的胡萝卜素作为人类及动物体内维生素A(retinol)合成的前体,是补充维生素A的最好途径。在人体和动物体内,β-胡萝卜素中部可裂解生成两个分子的维生素A,而含有一个β-环的α-胡萝卜素和β-隐黄质的裂解只能产生一个分子的维生素A。因此,如何利用代谢工程提高作物β-胡萝卜素含量,使人们在日常饮食中即可获得足够的天然β-胡萝卜素,成为研究的热点。因此我们克隆并鉴定β-胡萝卜素生物合成途径的关键酶基因,不仅有助于了解β-胡萝卜素生物合成与积累的调控机理,而且为通过基因工程手段调节代谢途径,定向地控制目的基因的表达,从而使植物高水平积累某一有价值的代谢产物的遗传工程提供目的基因。
本实验从龙胆花瓣cDNA文库中克隆到与龙胆INCB1酶切图谱和长度不同的另一克隆基因全长cDNA,命名为龙胆番茄红素β-环化酶2(GILNCB2),GenBank登陆号:EF062505。GILNCB2 cDNA核苷酸序列总长度为2165 bp,含有一段1.592 bp的不间断开放阅读框(open reading frame,ORF),177 bp的5末端和515 bp的3末端非编码区,在终止密码子(TAA)与多聚核苷酸之间具有poly(A)添加信号。GILYCB2编码一个含508个氨基酸残基的蛋白质,分子量57169.20 kD,等电点为8.64。由GILYCB2 cDNA序列所推导的氨基酸同源序列分析表明,该基因编码的蛋白可能是LYCB。利用含有GILYCB2基因的pBluescript-GILNCB2质粒扩增出的PCR产物与T载体连接,再亚克隆到pUC8表达载体上,构建表达质粒pUC-GILYCB2。应用可生成番茄红素的工程大肠杆菌(Escherichia.coli)鉴定了我们克隆的龙胆番茄红素β-环化酶2基因(cDNA),结果表明龙胆番茄红素β-环化酶2可将番茄红素转化为β-胡萝卜素。