【摘 要】
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基因组文库是进行分子克隆和基因组结构与功能研究的基础.完整的基因组文库的构建,使任何DNA片段的筛选和获得成为可能.随着不同克隆载体的相继出现,基因组文库也经历了一系
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基因组文库是进行分子克隆和基因组结构与功能研究的基础.完整的基因组文库的构建,使任何DNA片段的筛选和获得成为可能.随着不同克隆载体的相继出现,基因组文库也经历了一系列的发展过程.
本文提出了一种制备高质量盐芥基因组文库的方法.为下一步克隆盐芥中的基因以及进行其他分子生物学研究奠定了基础.本实验用CTAB抽提法、Dellaporta,Wood和Hicks法提取盐芥叶片基因组DNA,通过限制性内切酶Sad3A I,以终浓度O.025 U/ul为最适合的酶切浓度,30min为最适反应时间不完全酶切.用低熔点琼脂糖凝胶电泳回收并纯化后得到15～23 kb的DNA片段;通过限制性内切酶BanffI,BglⅡ完全酶切,回收得到盐芥完全酶切基因组片段.分别以LambdaFIXⅡ和L,ambda DASH Ⅱ噬菌体DNA为载体DNA.
本课题所采用的Lambda FIX Ⅱ和Lambda DASH Ⅱ噬菌体DNA载体都是经过改造的生物工程载体,它们的共同特点都是优先选择包装大片段DNA,包装范围有所不同.这两个系统都采用了spi筛选标记(对噬菌体溶素原P2敏感),那些具有活性 red和gam基因的λ-噬菌体将不能在含有P2筛选标记的宿主菌中生长[比如:XL1-Blue MRA(P2)],而不含有这两个基因的λ-噬菌体则可以在表达P2这种噬菌体溶素原的宿主菌中生长.red和gam基因在Lambda FIX Ⅱ和LambdaDASH Ⅱ噬菌体DNA中被定位在自身填充序列上,可以正常表达,因此,野生型λ-噬菌体(Lambda FIX Ⅱ和Lambda DASH Ⅱ)将不能在XL1-Blue:MRA(P2)宿主菌中生长.当填充片段被外源插入的DNA所替换时,重组噬菌体将变为red和gam,就可以在XI-1-Blue MRA(P2)宿主菌中生长,达到筛选阳性克隆的目的.所以,原则上只有那些经过重组的λ-噬菌体可以在以XL-1-Blue MRA(P2)为宿主菌的平板上存活,使所构建的文库呈现出良好的阳性表达效果.
用T4DNA连接酶将载体与DNA片段连接,得到重组DNA.经体外包装形成完整的噬菌体颗粒,转染宿主菌XL-1-Bluc MRA(P2),在NZY平板培养基上铺板培养回收得到基因组文库,滴度测定达到2×106pfu/ml,能够覆盖盐芥基因组14余倍,是质量很高的盐芥基因组文库.随机挑取一定数量的克隆子,提取噬菌体DNA,酶切分析结果发现克隆子携带外源DNA.以盐芥脯氨酸代谢通路中5个关键酶的基因:ThP5CS1,ThP5CS2,ThP5CDH,ThPDH,ThERD5,SOD家族5个基因CSD1,CSD3,ZnSOD,MSD,FSD以及过氧化氢酶基因CAT为探针,进行盐芥基因组文库的筛选.第一轮一筛得到18个阳性信号,二筛得到4个独立克隆.第二轮只用脯氨酸系统的基因片段做探针,一筛得到9个阳性信号,二筛正在进行中.对于已经得到的阳性克隆,目前正在进行鉴定工作.
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