齐氏补肾健脾方干预对DOR模型小鼠卵巢功能的影响及机制研究

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实验目的:本研究通过体内动物试验,观察齐氏补肾健脾方对VCD所致卵巢功能储备下降DOR雌性小鼠模型损伤调控机制,并探讨齐氏补肾健脾方改善卵巢功能的相关机制。观察齐氏补肾健脾方中菟丝子的有效单体槲皮素,在VCD状态环境下对于受精卵体外培养发育的影响,并探讨槲皮素提高体外受精卵发育潜能的相关途径和机制。  方法:运用VCD80mg/kg,腹腔注射15天对C57/BL小鼠进行造模。并对小鼠体重、卵巢重量、各级卵泡数目、血清AMH、FSH、LH、E2水平含量进行检测。造模成功后,运用齐氏补肾健脾方对VCD所致DOR雌性小鼠模型进行干预,并对各组小鼠的体重、卵巢重量各级卵泡数目、血清AMH、FSH、LH、E2水平含量进行检测,并通过基因蛋白分子手段对齐氏补肾健脾方干预的机制进行研究。将齐氏补肾健脾方中菟丝子有效单体槲皮素,干预VCD状态环境下小鼠受精卵体外发育培养。并通过2细胞期、桑葚胚胎期、囊胚期的形态学记录、DCFH-DA检测胚胎中ROS水平检测、JC-1荧光染色对胚胎中线粒体功能的评估、Tunel法对胚胎中凋亡细胞数目的计数、各抗氧化酶含量的测定。并通过基因蛋白分子手段对补肾健脾方干预的机制进行研究。  结果:VCD所致模型相对正常青年对照组,降低卵巢重量、减少各级卵泡数量、降低血清AMH、E2水平含量、提高血清FSH、LH水平含量,统计均具有统计学意义,P<0.01。模型组与青年组体重相较无统计学意义,P>0.05。运用齐氏补肾健脾方进行干预,可以提高卵巢重量(P<0.01),增加各级卵泡数量(P<0.01)、提高血清AMH、E2水平含量(P<0.01)、降低血清FSH、LH水平含量(P<0.01)。并在基因层面,可以提高CAT、GPx、SOD1、Sirt3基因表达(P<0.01),降低Foxo3a、P53基因表达(P<0.01),在蛋白印迹检测中可以降低凋亡因子P38的蛋白表达(P<0.01)。槲皮素干预VCD状态小鼠受精卵体外发育,能够明显增加桑椹期、囊胚期胚胎数目P<0.01,减少胚胎体内ROS水平P<0.01、胚胎线粒体功能中也提高了红色莹光与绿色荧光的比例P<0.01、减少胚胎体内阳性细胞数目P<0.01。在抗氧化酶的测定中,提高明显CAT、GPx、总抗氧化的水平含量均P<0.01,提高SOD1(P<0.05)。.并在基因层面,可以提高CAT、GPx、Sirt3基因表达均P<0.01,提高SOD1表达(P<0.05)。降低Foxo3a(P<0.01)、P53(P<0.05)基因表达。  结论:  (1)运用VCD可以成功进行卵巢功能下降小鼠模型的建立。  (2)在VCD所致DOR小鼠模型下,齐氏补肾健脾方的干预,能够提升各抗氧化剂的水平含量、降低凋亡因子的表达,来逆转模型小鼠卵巢功能。  (3) VCD状态下的小鼠受精卵发育,通过槲皮素的干预,能够明显提高胚胎的发育潜能,并且通过降低胚胎体内ROS水平、提高线粒体功能、减少凋亡细胞产生、促进抗氧化酶的活性、激活抗凋亡因子活性来降低VCD状态对小鼠胚胎的损害。
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