上个世纪九十年代发展的原位PCR技术,结合了PCR和原位杂交的优点,既可检测出样品中低拷贝的核酸,又可确定其细胞来源和细胞中的位置,至今已成为一项重要的形态学研究方法,利用原位RT-PCR检测果树病毒,对病毒在果树各组织中的分布进行定位,可为果树病毒检测提供一种新的途径,有助于我们了解病毒分布和传输的作用机制,对病毒的诊断、预防、治疗等提供了新的实验依据,也为果树无毒化生产提供了理论依据,具有重要的理论价值和生产实践意义。本实验用常规RT-PCR检测出携带葡萄茎痘病毒的葡萄样本,采集此样本和实生苗2㎜左右的茎尖组织,制成石蜡切片;用制备出的生物素标记的cDNA探针,在切片上进行直接原位RT-PCR和间接原位RT-PCR;通过观测经过显色系统检测后的组织,确定葡萄茎痘病毒在茎尖中的分布情况。本研究的主要内容和结论如下:1.制备出适合植物茎尖幼嫩组织的石蜡切片,得到葡萄茎尖这种幼嫩且含水量大的植物组织最佳的脱水酒精梯度和时间:组织经4%多聚甲醛固定1h,50%、70%、80%、90%、100%乙醇脱水各1h,适用于以茎尖为材料的原位RT-PCR。2.用常规液相RT-PCR成功获得长度为355bp的特异性片段。对特异性片段进行回收、连接、克隆,由上海生工进行测序。测序结果经BLAST(AF026278)比对,特异片段的同源性可达到89%。3.利用克隆质粒,用PCR法制备出生物素标记cDNA探针,探针长度为355bp,并确定合适的探针浓度应用于原位RT-PCR。4.建立了GRSPaV直接原位RT-PCR检测体系和间接原位RT-PCR检测体系。5.初步确定了葡萄茎痘病毒在茎尖中的分布位置。通过观测经原位RT-PCR免疫检测后的茎尖横剖切片和纵剖切片以及实验中的各种阴性对照切片,大致确定了葡萄茎痘病毒在茎尖中的分布:葡萄茎尖组织中葡萄茎痘病毒粒子主要集中分布于维管束,而其他地方的细胞中只有很少量的病毒分布,在茎尖0.2㎜以上的分生区不带病毒。