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扭脱甲基杆菌(MethylobacteriumextorquensAM1，以下简称AM1菌)是以甲醇为唯一碳源和能源进行生长代谢的有机碳一代谢模式菌株。本论文以扭脱甲基杆菌为宿主，以异丁醇为目标产物，首次实现了以甲醇为唯一碳源生产多元醇类化合物。搭建甲醇高效转化为异丁醇的微生物细胞工厂，为醇类物质的合成提供通用生物合成平台。
异丁醇合成的细胞内直接前体代谢物是2-酮异戊酸，因而可以引入异源基因kivd(编码2-酮酸脱羧酶2-Ketoisovaleratedecarboxylase，KDC，催化2-酮异戊酸到异丁醛)和基因adhAR(编码醇脱氢酶Alcoholdehydrogenases，ADH，催化异丁醛到异丁醇)构建异丁醇合成途径。本研究首先选择来源于乳酸乳球菌的KDC及其突变酶的编码基因(kivd，kivdV461I和kivdS286T)以及来源于乳酸乳球菌的ADH编码基因(adhAR)，在表达型质粒pCM80中以PmxaF启动子驱动构建出三套人工双顺反子(pCM80-PmxaF-kivd-adhAR，pCM80-PmxaF-kivdS286T-adhAR和pCM80-PmxaF-kivdV461I--adhAR)，获得重组基因工程菌YIS2、YIS3、YIS4，胞外异丁醇产量分别是0.05mg/L、0.105mg/L和0.114mg/L，初步实现了异丁醇产量从无到有。考虑到产量低，根据前期文献报道，替换第二步催化反应的醇脱氢酶，选择来源于大肠杆菌ADH的编码基因(yqhD)，重新构建重组质粒(pCM80-PmxaF-kivdS286T-yqhD和pCM80-PmxaF-kivdV461I--yqhD)电转入AM1菌，重组基因工程菌YIS9、YIS10产量分别是0.624mg/L和0.415mg/L。SDS-PAGE胶图分析表明，在AM1菌基因yqhd表达重组酶的浓度显著高于基因adhAR表达浓度，这可能是产量提高12倍的原因。
利用气相质谱对YIS9进行代谢组数据检测，通过分析发现2-酮异戊酸胞内含量相比于对照菌株下降5倍，强化2-酮异戊酸的代谢通量可能有利于提高异丁醇的产量。因而引入异源基因alss(编码乙酰乳酸合成酶Acetolactatesynthase，ALS，催化丙酮酸到2-乙酰乳酸)将可能有利于2-酮异戊酸代谢合成通量的提高。本研究选择来源于枯草芽孢杆菌的ALS的编码基因(alss)，在表达型质粒pCM80中以PmxaF启动子驱动构建出(pCM80-PmxaF-kivdS286T-yqhD-PmxaF-alss)，获得重组基因工程菌YIS14，胞外异丁醇产量为3.6mg/L。进一步通过代谢组对代谢流进行解析发现，重组基因工程菌株YIS14中2-酮异戊酸胞内含量相较于对照菌株提高2.7倍，2-酮异戊酸产生的缬氨酸和亮氨酸胞内含量相较于对照菌株分别提高8倍和2.5倍。因此基因alss的引入提高了胞内2-酮异戊酸的含量。异丁醇是生长依赖型产品，实验室前期突变菌株MethylobacteriumextorquensBHBT5(以下简称BHBT5)和AM1菌株相比生长速率提高1.3倍，异丁醇耐受性为4.8g/L，因此后期实验选择BHBT5作为宿主菌用于异丁醇生物合成研究。为了增加前体物胞内含量，首先通过基因敲除技术，敲除基因ldhA(编码乳酸脱氢酶，LDH，催化丙酮酸去往乳酸)，敲除成功后，得到菌株BHBT5?ldhA，将重组质粒(pCM80-PmxaF--kivdS286T-yqhD-PmxaF-alss)电转至BHBT5?ldhA，构建重组基因工程菌株YIS18异丁醇产量达到12mg/L。为进一步增加2-酮异戊酸的消耗，通过增加异源基因的拷贝数，增加启动子强度获得了YIS19菌株BHBT5?ldhA::pCM80?plac-kivdS286T--yqhD-PmxaF-kivdS286T-yqhD-PmxaF-alss，异丁醇产量达到18mg/L。对YIS17菌株BHBT5::pCM80-kivdS286T-yqhD-PmxaF-alss在2.5-L发酵罐进行批式发酵，异丁醇产量达24mg/L。
通过本论文的工作，不仅证明了扭脱甲基杆菌作为甲醇基微生物细胞工厂的重要的应用潜力，而且首次实现了以甲醇为唯一碳源生产醇类化合物，对基于甲基合成路线生产生物基材料具有重要的借鉴意义。
异丁醇合成的细胞内直接前体代谢物是2-酮异戊酸，因而可以引入异源基因kivd(编码2-酮酸脱羧酶2-Ketoisovaleratedecarboxylase，KDC，催化2-酮异戊酸到异丁醛)和基因adhAR(编码醇脱氢酶Alcoholdehydrogenases，ADH，催化异丁醛到异丁醇)构建异丁醇合成途径。本研究首先选择来源于乳酸乳球菌的KDC及其突变酶的编码基因(kivd，kivdV461I和kivdS286T)以及来源于乳酸乳球菌的ADH编码基因(adhAR)，在表达型质粒pCM80中以PmxaF启动子驱动构建出三套人工双顺反子(pCM80-PmxaF-kivd-adhAR，pCM80-PmxaF-kivdS286T-adhAR和pCM80-PmxaF-kivdV461I--adhAR)，获得重组基因工程菌YIS2、YIS3、YIS4，胞外异丁醇产量分别是0.05mg/L、0.105mg/L和0.114mg/L，初步实现了异丁醇产量从无到有。考虑到产量低，根据前期文献报道，替换第二步催化反应的醇脱氢酶，选择来源于大肠杆菌ADH的编码基因(yqhD)，重新构建重组质粒(pCM80-PmxaF-kivdS286T-yqhD和pCM80-PmxaF-kivdV461I--yqhD)电转入AM1菌，重组基因工程菌YIS9、YIS10产量分别是0.624mg/L和0.415mg/L。SDS-PAGE胶图分析表明，在AM1菌基因yqhd表达重组酶的浓度显著高于基因adhAR表达浓度，这可能是产量提高12倍的原因。
利用气相质谱对YIS9进行代谢组数据检测，通过分析发现2-酮异戊酸胞内含量相比于对照菌株下降5倍，强化2-酮异戊酸的代谢通量可能有利于提高异丁醇的产量。因而引入异源基因alss(编码乙酰乳酸合成酶Acetolactatesynthase，ALS，催化丙酮酸到2-乙酰乳酸)将可能有利于2-酮异戊酸代谢合成通量的提高。本研究选择来源于枯草芽孢杆菌的ALS的编码基因(alss)，在表达型质粒pCM80中以PmxaF启动子驱动构建出(pCM80-PmxaF-kivdS286T-yqhD-PmxaF-alss)，获得重组基因工程菌YIS14，胞外异丁醇产量为3.6mg/L。进一步通过代谢组对代谢流进行解析发现，重组基因工程菌株YIS14中2-酮异戊酸胞内含量相较于对照菌株提高2.7倍，2-酮异戊酸产生的缬氨酸和亮氨酸胞内含量相较于对照菌株分别提高8倍和2.5倍。因此基因alss的引入提高了胞内2-酮异戊酸的含量。异丁醇是生长依赖型产品，实验室前期突变菌株MethylobacteriumextorquensBHBT5(以下简称BHBT5)和AM1菌株相比生长速率提高1.3倍，异丁醇耐受性为4.8g/L，因此后期实验选择BHBT5作为宿主菌用于异丁醇生物合成研究。为了增加前体物胞内含量，首先通过基因敲除技术，敲除基因ldhA(编码乳酸脱氢酶，LDH，催化丙酮酸去往乳酸)，敲除成功后，得到菌株BHBT5?ldhA，将重组质粒(pCM80-PmxaF--kivdS286T-yqhD-PmxaF-alss)电转至BHBT5?ldhA，构建重组基因工程菌株YIS18异丁醇产量达到12mg/L。为进一步增加2-酮异戊酸的消耗，通过增加异源基因的拷贝数，增加启动子强度获得了YIS19菌株BHBT5?ldhA::pCM80?plac-kivdS286T--yqhD-PmxaF-kivdS286T-yqhD-PmxaF-alss，异丁醇产量达到18mg/L。对YIS17菌株BHBT5::pCM80-kivdS286T-yqhD-PmxaF-alss在2.5-L发酵罐进行批式发酵，异丁醇产量达24mg/L。
通过本论文的工作，不仅证明了扭脱甲基杆菌作为甲醇基微生物细胞工厂的重要的应用潜力，而且首次实现了以甲醇为唯一碳源生产醇类化合物，对基于甲基合成路线生产生物基材料具有重要的借鉴意义。