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富含半胱氨酸因子61（CYR61）在结肠癌中高表达，并且和结肠癌病人的不良预后相关；近期的研究发现，某些增强子的异常调控能够促使基因表达异常，从而促进肿瘤的发生发展，但是目前关于增强子对CYR61的表达调控尚未见报道。
首先结肠癌病人标本的免疫组化（IHC）结果（42例：癌-癌旁）显示，结肠癌癌组织中，CYR61的表达明显高于癌旁组织，并且和肿瘤的分级呈正相关关系；ONCOMINE芯片数据集分析结果也显示结肠癌癌组织中CYR61mRNA的表达量明显高于正常结肠组织。结肠细胞株中，CYR61mRNA和蛋白的表达情况和病人组织样品的表达情况一致，在癌细胞株LoVo、C2BBe1、HCT116、SW480和RKO中，显著高于正常结肠粘膜细胞株NCM460。
从GEO下载的结肠癌病人基因组组蛋白修饰的ChIP-seq数据（H3K27ac、H3K4me1和H3K4me3）分析结果显示，在结肠癌病人样本中，CYR61基因下游，距CYR61基因转录起始位点26.5kb，31.5kb和48.6kb处，有3个潜在的增强子。后续我们通过细胞实验进行验证，以确认这3个潜在的增强子是否为CYR61基因的活性增强子。通过检测eRNA表达情况、ChIP-qPCR、双荧光素酶实验和染色质构象捕获实验（3C实验），我们发现在正常结肠粘膜细胞株NCM460中，没有CYR61的活性增强子，而在结肠癌细胞HCT116和RKO中都有CYR61的活性增强子，与结肠癌病人组织的ChIP-seq数据分析结果一致。另外，虽然结肠癌细胞HCT116和RKO中都有CYR61的活性增强子，但是它们的增强子调控情况也不完全一样：在HCT116中，只存在一个活性增强子，Enhancer3；而在RKO中，存在两个活性增强子，Enhancer1和Enhancer3。
通过查找共同存在于启动子和增强子片段的转录因子结合基序，我们发现转录因子FOXA1在CYR61的启动子区、Enhancer1和Enhancer3都有潜在的结合位点；另外，在以往报道中，FOXA1可以作为先锋转录因子，调控增强子的功能，所以我们通过对FOXA1进行敲降和过表达实验，来探索FOXA1是否影响CYR61增强子活性以及CYR61的表达。FOXA1的敲降，可以引起RKO细胞和SW480细胞中CYR61mRNA和蛋白表达下降；同时，在RKO细胞中，标志增强子活化水平的E1-eRNA、E3-eRNA表达水平和增强子区的H3K27ac修饰水平也下降，并且增强子和启动子间的环袢结合频率也下降。FOXA1的过表达，可以引起HCT116细胞和SW480细胞中CYR61mRNA和蛋白表达增加；同时，在HCT116细胞中E3-eRNA表达水平和增强子区的H3K27ac修饰水平也增加，并且增强子和启动子间的环袢形成频率也增加。这说明FOXA1在介导了CYR61启动子和增强子之间环袢结合，也具有促进启动子和增强子区染色质活化的作用。另外，FOXA1敲降和过表达后的双荧光素酶活性实验显示，FOXA1主要是通过影响增强子活性来影响CYR61的启动子活性的。
因为FOXA1在增强子区的富集状态影响了组蛋白乙酰化修饰（H3K27ac），所以我们进一步探究FOXA1是否通过招募乙酰化酶在增强子区的结合，来调控组蛋白的乙酰化状态。并且FOXA1的敲降和过表达，改变了FOXA1在CYR61启动子区和增强子区的富集状态，也引起了同向性的组蛋白乙酰化酶CBP富集改变。为了明确FOXA1是否通过影响CBP的结合，进而影响增强子活性，我们在RKO和SW480细胞里对CBP进行敲降实验。CBP的敲降，可以引起RKO细胞和SW480细胞中CYR61mRNA和蛋白表达下降；同时，在RKO细胞中E1-eRNA、E3-eRNA表达水平和增强子区的H3K27ac修饰水平也下降，并且增强子Enhancer1和启动子间的环袢形成频率也下降。这说明CBP也介导了CYR61启动子和增强子之间环袢形成，同时具有促进启动子和增强子区染色质活化的作用。另外，FOXA1和CBP的敲降，并不影响彼此的表达量；并且CBP的敲降也不影响FOXA1在CYR61启动子区和增强子区的富集状态。这部分实验结果结合前面的FOXA1敲降/过表达后的CBP的富集减少/增加结果，说明，FOXA1通过招募CBP的结合，来构建染色质的活化状态。
在小分子化合物佛波酯（TPA）和维替泊芬（VP）刺激结肠癌细胞，诱发CYR61表达上调和下降的实验中，TPA刺激引起CYR61和eRNAs表达增加，同时CBP及H3K27ac在CYR61启动子区和增强子区的富集增加，以及启动子区和增强子的环袢结合频率上升；VP刺激引起CYR61和eRNA表达下降，同时CBP及H3K27ac在CYR61启动子区和增强子区的富集减少，以及启动子区和增强子的环袢结合频率也出现了相应的变化。结合前面转录因子通过改变增强子活性来调控CYR61表达的结果，说明增强子也参与了药物对CYR61表达的调控。
细胞迁移功能实验中，在HCT116细胞中，过表达CYR61能够促进细胞的迁移能力；相反，在RKO细胞里面，敲降CYR61能够抑制细胞迁移能力。敲降或过表达CYR61能够逆转过表达或敲降FOXA1引起的细胞迁移能力改变。说明了FOXA1通过介导增强子对CYR61表达的调控，从而改变肿瘤细胞的迁移能力。在小鼠尾静脉注射观察肿瘤转移实验中，过表达FOXA1的HCT116细胞中，CYR61表达水平上升，肿瘤细胞转移能力增强；相反，在过表达FOXA1的HCT116细胞中同时敲降CYR61，肿瘤细胞在小鼠体内的肺转移能力下降。
综上所述，我们的研究结果表明，异常的CYR61基因活性增强子存在于结肠癌中，而在正常组织中并不呈现活化状态。异常的活性增强子通过增强CYR61基因的表达，从而促进结肠癌细胞的迁移。先锋转录因子FOXA1和组蛋白乙酰化酶CBP通过介导结肠癌中CYR61基因的活性增强子和启动子的环袢结合，调控增强子的活性，从而促进CYR61基因的表达。本研究探讨了FOXA1和CBP介导增强子对CYR61基因的调控机制，阐明了增强子对CYR61的调控在结肠癌中的致病机制。位点特异性地抑制CYR61基因启动子区和活性增强子区的转录因子结合能力，具有潜在的结肠癌治疗价值。
首先结肠癌病人标本的免疫组化（IHC）结果（42例：癌-癌旁）显示，结肠癌癌组织中，CYR61的表达明显高于癌旁组织，并且和肿瘤的分级呈正相关关系；ONCOMINE芯片数据集分析结果也显示结肠癌癌组织中CYR61mRNA的表达量明显高于正常结肠组织。结肠细胞株中，CYR61mRNA和蛋白的表达情况和病人组织样品的表达情况一致，在癌细胞株LoVo、C2BBe1、HCT116、SW480和RKO中，显著高于正常结肠粘膜细胞株NCM460。
从GEO下载的结肠癌病人基因组组蛋白修饰的ChIP-seq数据（H3K27ac、H3K4me1和H3K4me3）分析结果显示，在结肠癌病人样本中，CYR61基因下游，距CYR61基因转录起始位点26.5kb，31.5kb和48.6kb处，有3个潜在的增强子。后续我们通过细胞实验进行验证，以确认这3个潜在的增强子是否为CYR61基因的活性增强子。通过检测eRNA表达情况、ChIP-qPCR、双荧光素酶实验和染色质构象捕获实验（3C实验），我们发现在正常结肠粘膜细胞株NCM460中，没有CYR61的活性增强子，而在结肠癌细胞HCT116和RKO中都有CYR61的活性增强子，与结肠癌病人组织的ChIP-seq数据分析结果一致。另外，虽然结肠癌细胞HCT116和RKO中都有CYR61的活性增强子，但是它们的增强子调控情况也不完全一样：在HCT116中，只存在一个活性增强子，Enhancer3；而在RKO中，存在两个活性增强子，Enhancer1和Enhancer3。
通过查找共同存在于启动子和增强子片段的转录因子结合基序，我们发现转录因子FOXA1在CYR61的启动子区、Enhancer1和Enhancer3都有潜在的结合位点；另外，在以往报道中，FOXA1可以作为先锋转录因子，调控增强子的功能，所以我们通过对FOXA1进行敲降和过表达实验，来探索FOXA1是否影响CYR61增强子活性以及CYR61的表达。FOXA1的敲降，可以引起RKO细胞和SW480细胞中CYR61mRNA和蛋白表达下降；同时，在RKO细胞中，标志增强子活化水平的E1-eRNA、E3-eRNA表达水平和增强子区的H3K27ac修饰水平也下降，并且增强子和启动子间的环袢结合频率也下降。FOXA1的过表达，可以引起HCT116细胞和SW480细胞中CYR61mRNA和蛋白表达增加；同时，在HCT116细胞中E3-eRNA表达水平和增强子区的H3K27ac修饰水平也增加，并且增强子和启动子间的环袢形成频率也增加。这说明FOXA1在介导了CYR61启动子和增强子之间环袢结合，也具有促进启动子和增强子区染色质活化的作用。另外，FOXA1敲降和过表达后的双荧光素酶活性实验显示，FOXA1主要是通过影响增强子活性来影响CYR61的启动子活性的。
因为FOXA1在增强子区的富集状态影响了组蛋白乙酰化修饰（H3K27ac），所以我们进一步探究FOXA1是否通过招募乙酰化酶在增强子区的结合，来调控组蛋白的乙酰化状态。并且FOXA1的敲降和过表达，改变了FOXA1在CYR61启动子区和增强子区的富集状态，也引起了同向性的组蛋白乙酰化酶CBP富集改变。为了明确FOXA1是否通过影响CBP的结合，进而影响增强子活性，我们在RKO和SW480细胞里对CBP进行敲降实验。CBP的敲降，可以引起RKO细胞和SW480细胞中CYR61mRNA和蛋白表达下降；同时，在RKO细胞中E1-eRNA、E3-eRNA表达水平和增强子区的H3K27ac修饰水平也下降，并且增强子Enhancer1和启动子间的环袢形成频率也下降。这说明CBP也介导了CYR61启动子和增强子之间环袢形成，同时具有促进启动子和增强子区染色质活化的作用。另外，FOXA1和CBP的敲降，并不影响彼此的表达量；并且CBP的敲降也不影响FOXA1在CYR61启动子区和增强子区的富集状态。这部分实验结果结合前面的FOXA1敲降/过表达后的CBP的富集减少/增加结果，说明，FOXA1通过招募CBP的结合，来构建染色质的活化状态。
在小分子化合物佛波酯（TPA）和维替泊芬（VP）刺激结肠癌细胞，诱发CYR61表达上调和下降的实验中，TPA刺激引起CYR61和eRNAs表达增加，同时CBP及H3K27ac在CYR61启动子区和增强子区的富集增加，以及启动子区和增强子的环袢结合频率上升；VP刺激引起CYR61和eRNA表达下降，同时CBP及H3K27ac在CYR61启动子区和增强子区的富集减少，以及启动子区和增强子的环袢结合频率也出现了相应的变化。结合前面转录因子通过改变增强子活性来调控CYR61表达的结果，说明增强子也参与了药物对CYR61表达的调控。
细胞迁移功能实验中，在HCT116细胞中，过表达CYR61能够促进细胞的迁移能力；相反，在RKO细胞里面，敲降CYR61能够抑制细胞迁移能力。敲降或过表达CYR61能够逆转过表达或敲降FOXA1引起的细胞迁移能力改变。说明了FOXA1通过介导增强子对CYR61表达的调控，从而改变肿瘤细胞的迁移能力。在小鼠尾静脉注射观察肿瘤转移实验中，过表达FOXA1的HCT116细胞中，CYR61表达水平上升，肿瘤细胞转移能力增强；相反，在过表达FOXA1的HCT116细胞中同时敲降CYR61，肿瘤细胞在小鼠体内的肺转移能力下降。
综上所述，我们的研究结果表明，异常的CYR61基因活性增强子存在于结肠癌中，而在正常组织中并不呈现活化状态。异常的活性增强子通过增强CYR61基因的表达，从而促进结肠癌细胞的迁移。先锋转录因子FOXA1和组蛋白乙酰化酶CBP通过介导结肠癌中CYR61基因的活性增强子和启动子的环袢结合，调控增强子的活性，从而促进CYR61基因的表达。本研究探讨了FOXA1和CBP介导增强子对CYR61基因的调控机制，阐明了增强子对CYR61的调控在结肠癌中的致病机制。位点特异性地抑制CYR61基因启动子区和活性增强子区的转录因子结合能力，具有潜在的结肠癌治疗价值。