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目的: 观察人参皂甙Rb1对低氧大鼠肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterysmooth muscle cells,PASMCs)五羟色胺转运体(serotonintransporter,SERT)和5-羟色胺1B受体(serotonin1B Receptor,5-HT1BR)表达及细胞增殖的影响。 方法:实验由以下三部分组成: (1)Ⅰ型胶原酶消化法提取单个PASMCs:用Ⅰ型胶原酶消化法分离成年雄性SD大鼠肺动脉平滑肌细胞,进行PASMCs原代培养并传代培养。倒置相差显微镜下观察原代培养的PASMCs的形态,细胞免疫荧光法鉴定PASMCs的纯度。将第4~6代生长良好的细胞随机分组:常氧组(N:37℃,21%O2,5%CO2)、低氧组(H:37℃,3% O2,5%CO2)、低氧加人参皂甙Rb1(50mg/L、100mg/L、200mg/L)组,孵育24小时。 (2)低氧和人参皂甙Rb1对大鼠PASMCs增殖的影响:取对数期的PASMCs经饥饿同步化处理,加入人参皂甙Rb1后,在常氧或低氧条件下培养24h。采用Cell Counting Kit-8试剂盒检测低氧和不同浓度人参皂甙Rb1对PASMCs增殖的影响; (3)低氧和人参皂甙Rb1对大鼠PASMCs中SERT和5-HT1BR表达的影响:取对数期的PASMCs经饥饿同步化处理,加入人参皂甙Rb1后,在常氧或低氧条件下培养24h。用逆转录-聚合酶连反应(RT-PCR法)和免疫印迹法(Western Blot)分别检测PASMCs的SERT和5-HT1BR的mRNA和蛋白水平表达。 结果: (1)A.倒置相差显微镜下观察到,细胞呈长梭形或三角形生长,大小不一,重叠交织排铺。单个或多个细胞核呈卵圆形位于细胞内。培养至5-7d,培养皿内细胞密度低处呈网格状,密度高处呈栅栏状,呈现出平滑肌细胞特有的“峰-谷”状生长。 B.细胞经α-actin单克隆抗体孵育、FITC标记的二抗染色和DAPI复染后,在激光共聚焦显微镜下观察到平滑肌平滑肌α-肌动蛋白呈现绿色荧光,以纤维细丝状排列;DAPI染色的细胞核呈卵圆形,发蓝色荧光,阳性率达98%以上。 (2)CCK-8检测结果显示:与常氧组比较,低氧组细胞增生明显增加(P<0.01)。与低氧组比较,人参皂甙Rb1以剂量依赖性方式(50mg/L、100mg/L和200mg/L)抑制PASMCs增生,其对低氧PASMCs增生的抑制率分别为(13.2±2.9)%,(19.0±2.8)%,(24.2±9.5)%。与Rb150mg/L组比较,100mg/L和200mg/L组对低氧PASMCs增生的抑制率也具有显著意义(P<0.05)。 (3)A.RT-PCR结果显示:与N组比较,H组SERT和5-HT1BR mRNA表达均升高(P<0.01);与H组比较,不同浓度人参皂甙Rb1组SERT和5-HT1BR mRNA表达均明显下调(P<0.01),SERT和5-HT1BR mRNA表达呈浓度依赖性降低,Rb150组<Rb1100组<Rb1200组;与Rb150组比较,Rb1100组和Rb200组SERT mRNA表达均显著降低(P<0.01),5-HT1BR mRNA表达也明显降低(P<0.05,P<0.01)。B.Western Blot结果显示:与N组比较,H组SERT和5-HT1BR蛋白量表达明显升高(P<0.05)。与H组比较,不同浓度人参皂甙Rb1组SERT和5-HT1BR蛋白表达均明显下调(P<0.01),呈浓度依赖性降低;与Rb150组比较,Rb1100组和Rb200组SERT和5-HT1BR蛋白表达均显著降低(P<0.01) 结论: (1)单纯低氧条件刺激下,大鼠PASMCs发生明显的增殖,而经人参皂甙Rb1干预后,可明显抑制低氧下的PASMCs的增殖,这为研究人参皂甙Rb1预防肺血管增生狭窄提供了新的线索。 (2)急性低氧环境下,PASMCs的SERT和5-HT1BR基因水平和蛋白水平表达均明显增加,加速了PASMCs的增殖。不同浓度(Rb150、Rb1100、Rb1200)的人参皂甙Rb1干预后,SERT和5-HT1BR基因水平和蛋白的表达以剂量依赖方式降低,其中以Rb1200组的浓度最为明显。这提示人参皂甙Rb1可能通过降低SERT和5-HT1BR的表达,减少PASMCs在低氧下的增殖,缓解肺动脉高压(Pulmonary Arterial Hypertension,PAH)的发生。