大量报导显示，来源于爱滋病毒HIV-1的TAT(Trans-actor)蛋白转导结构域(protein transduction domain，PTD)(残基47-57)具有介导外源大分子跨膜递送进入哺乳动物细胞的能力，在基因治疗和大分子药物载体方面展示了良好的应用前景。如果TAT-PTD(以下简称TAT)也能够介导大分子进入昆虫细胞，将为开发高效农药，转基因抗虫植物提供新的思路。 本论文以绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)和蜘蛛毒素蛋白(w-Atracotoxin-Hvla，ACIX)作为模型蛋白，研究其与TAT偶连后穿膜作用与毒性的改变。为构建模型蛋白，本研究构建了基于质粒pET22b(+)的表达载体pET-TAT-GFP、pET-TAT-ACTX，和基于质粒pGEX4T-2的表达载体pGEX-TAT-GFP，分别表达融合蛋白TAT-GFP，TAT-ACTX，GST-TAT-GFP。同时，为表达不含TAT的融合蛋白GFP，ACTX，GST-GFP作为对照，构建了表达载体pGFP，pTAT-ACTX，和pGEX4T-2。将表达载体转化至表达宿主菌Rosetta，经IFTG在低温下诱导表达，分别使用Ni-NTA，GS-4B亲和基质，在超声裂解液上清中纯化出具有活性的重组蛋白TAT-GFP、GFP，TAT-ACTX、ACTX以及TAT-GST-GFP、GST-GFP。 在此基础上，用荧光显微镜观察TAT-GFP和GST-TAT-GFP对体外培养的昆虫细胞sf-9的跨膜转导作用，同时分别以GFP和GST-GFP作为对照。结果显示：在与TAT-GFP和GST-TAT-GFP共培养6小时后，sf-9细胞在荧光显微镜下观察显绿色荧光，而对照则否。这一结果表明TAT能够都够有效转导GFP跨膜进入sf-9细胞，并且转导功能不受TAT在大分子中的位置的影响。通过胰酶洗涤除去可能吸附在细胞表面的TAT-GFP，收集细胞，超声裂解，检测上清液的荧光强度，结果TAT-GFP确实进入了细胞内，而不是吸附在细胞表面。 以重组蜘蛛毒蛋白ACTX，TAT-ACTX对桔小实蝇作用，分别测定二者对桔小实蝇的半数致死量LD<,50>。结果表明：ACTX对桔小实蝇的LD<,50>为16.9ng/只，LD<,50>的95％置信区间为15.9-17.9 ng/只；TAT-ACTX对桔小实蝇的LD<,50>为188 ng/只，LD<,50>的95％置信区间为177-199 ng/只。说明成功表达了具有生物活性的蜘蛛毒蛋白ACTX与TAT-ACrX。其中TAT的融合并未使TAT-ACTX提高毒性，而是比ACTX的毒性更低，可能是TAT的存在掩盖了ACTX的部分活性位点或改变了ACTX的空间结构。 总之，本研究表达纯化了具有活性的GFP、TAT-GFP、GST-GFP、GFT-TAT-GFP、ACTX、TAT-ATCX，并且证明TAT肽能够转导大分子进入体外培养的昆虫细胞sf-9。