基于斑马鱼EROD酶的多环芳烃活体快速检测方法

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本文以苯并[a]芘(B[a]P)、苯并[k]荧蒽(B[k]F)两种典型的多环芳烃为诱导化合物,以斑马鱼(Brachydaniorerio)为受试生物,采用短期活体暴露的方法研究斑马鱼7-乙氧基.异吩唑酮.脱乙基酶(EROD)测试反应动力学基本特征,优化了斑马鱼EROD酶活测定方法:通过时间-效应和浓度-效应实验,确定多环芳烃对斑马鱼急性毒性的最佳暴露时间和半效应浓度,进而探讨斑马鱼肝脏EROD作为多环芳烃污染生化检测技术的可行性;在斑马鱼肝脏EROD、SOD、CAT以及肠道EROD多种典型的分子生物学指标综合测定研究的基础上,揭示典型多环芳烃污染物对斑马鱼急性致毒的范围和途径,筛选出以斑马鱼为受试生物的最佳多环芳烃急性污染指标。结果显示: 1、在测定EROD荧光产物RF时,将激发、发射波长分别设定为550nm、585nm能够极大地避免瑞利散射的影响,并且能够将荧光底物ERF对产物RF荧光信号的干扰降到最低,最大限度地保证RF测定的灵敏性和准确性。实验还表明RF荧光强度在自然光暴露3d内都不会受到显著影响,这种荧光稳定性进一步保证了分子荧光法测定EROD活性的精确度。 2、基于对蛋白含量、底物浓度、辅酶浓度以及反应时间等斑马鱼EROD测试反应动力学影响因素的研究,确定斑马鱼EROD最佳测试条件为pH=7.8,恒温28℃的体系,其中包括50μ110%斑马鱼肝脏S9样品(约含700μg蛋白),30μlOD482=1.5的底物溶液和30μl20mg/mlNADPH。 3、两种典型多环芳烃(B[a]P和B[k]F)急性暴露条件(0-72h)下斑马鱼肝脏EROD活性呈现出比较一致的浓度-效应和时间-效应关系。其中时间-效应关系表现为EROD活性在暴露之初将随着时间的延长而升高,在一定时间后该活性便会随时间延长而降低;而浓度-效应则表现为在低诱导物浓度水平,EROD活性首先随诱导物浓度的升高而升高,当浓度达到一定限值后,其活性将维持在某一峰值附近,不再有显著变化。在时加间-效应关系测试试验中,0.1μMB[k]F和1μMB[a]P在暴露6h时斑马鱼肝脏EROD活性即可达到对照组的2.3倍左右,而0.1μMB[k]F和1μMB[a]P分别暴露12h和18h时EROD活性达到最大值,分别为对照组的3.5倍和6.7倍。浓度.效应关系测试试验则表明,B[k]F比B[a]P对斑马鱼肝脏EROD活性具有更强的诱导活性,且急性暴露下的B[k]F和B[a]P对斑马鱼肝脏EROD活性的最低效应浓度分别不超过0.05μM和0.1gM(等价于12.6μg/L和25.2μg/L)。因此,斑马鱼肝脏EROD活性是指示多环芳烃急性污染程度的一种敏感指标。 4、对于多环芳烃急性暴露下斑马鱼肠道EROD以及肝脏SOD、CAT的研究表明,0.01μMB[k]F短期(0-48h)暴露并不能引起斑马鱼肠道EROD的显著响应,而0.01-1μMB[k]F和0.05-2μMB[a]P在短期暴露条件下对斑马鱼肝脏SOD、CAT活性的影响比较不稳定,且没有出现规律性的时间.效应关系或浓度.效应关系。因此斑马鱼肠道EROD以及肝脏SOD、CAT都不能作为合适的多环芳烃急性暴露指标。
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