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研究背景：大肠癌是常见的恶性肿瘤之一，全世界范围内大肠癌的平均发病率处于恶性肿瘤的第三位，在美国等发达国家，大肠癌发病率和死亡率处于第二位。随着生活水平的提高和生活方式改变，近年来中国大肠癌的发病率在不断升高，特别是一些沿海发达城市大肠癌的发病率和增长率更高，已居恶性肿瘤的第二位。目前大肠癌的治疗以手术切除癌肿为首选，辅以放射、化疗、生物免疫治疗、靶向治疗等。但是多数患者在就诊时多处于中晚期，加之现有化疗药物毒副作用较大，限制了化疗药物的长期应用，患者预后较差，已有转移的患者5年生存率不到10％。因此寻求特异性高、毒副作用低的抗癌药物，仍然是当前大肠癌研究的热点。中医中药以其独特的疗效已成为当前抗肿瘤的研究热点，蟾毒灵(bufalin是从中药蟾酥中提取的多羟基甾体化合物，其分子式为C24H34O4，已研究表明蟾毒灵能够在体外和体内选择性地对白血病、肝癌、胃癌、胰腺癌等多种肿瘤具有杀伤及抑制作用，能够促进肿瘤细胞分化和诱导肿瘤细胞凋亡。据文献报道和我们的前期研究表明，蟾毒灵在体外对大肠癌肿瘤细胞有抑制作用，但是蟾毒灵体内对大肠癌是否有抗肿瘤作用还不清楚。因此为进一步研究蟾毒灵对大肠癌的抗肿瘤作用，我们建立了大肠癌裸鼠原位移植瘤模型，进一步探讨其体内对大肠癌的作用及其机制。
目的：观察不同剂量蟾毒灵对裸鼠大肠癌原位移植瘤的作用，从细胞凋亡角度揭示蟾毒灵抗肿瘤的作用机制。
方法：采用皮下注射人结肠癌HCT116细胞建立皮下移植瘤，再用组织块原位移植法建立裸鼠大肠癌原位移植瘤模型，将60只裸鼠用随机数字表法随机分为生理盐水(NS)组、5-FU组、蟾毒灵低(BL)、中(BM)、高(BH)剂量组5组，于造模后第15d至第21d采用腹腔注射方法给药，分别注射生理盐水0.2mL/只、5-FU25mg/kg、蟾毒灵0.5mg/kg、1.0mg/kg、1.5mg/kg，每天一次，于造模后第24天处死每组6只裸鼠，剩余6只观察生存期，记录给药期间裸鼠饮食和精神状态变化，称量给药前和给药后裸鼠体重的变化，记录裸鼠的带瘤生存期，采用光学显微镜和电镜方法观察蟾毒灵对裸鼠移植瘤瘤体、肝、肺等组织的影响；采用TUNEL法检测移植瘤细胞凋亡指数；采用荧光定量PCR法检查Bcl-xL、Bax、Caspase-3mRNA的表达；采用免疫组织化学方法和Western-bloting方法检测移植瘤Bcl-xL、Bax、Caspase-3蛋白的表达。
结果：(1)人结肠癌HCT116细胞株皮下移植瘤平均传代周期(瘤体直径长至0.8～1.2cm)为10d，原位移植瘤接种后第10d可以在裸鼠腹部触及肿瘤生长，第12d随机剖腹探查5只造模裸鼠均有肿瘤生长直径约0.8～1.0cm。治疗期间蟾毒灵各剂量组对裸鼠的饮食、精神状态未见明显异常，治疗前后蟾毒灵各剂量组裸鼠体重与NS组相比较无明显差异(P＞0.05);5-FU组在治疗期间裸鼠逐渐消瘦，治疗后裸鼠体重与NS组相比较明显减轻(P＜0.01);(2)5-FU组、BL组、BM组、BH组的肿瘤抑制率分别为69.6%、45.6%、56.2%、58.5%，肿瘤体积与NS组比较明显缩小(P＜0.01或P＜0.05);(3)NS组、5-FU组和BL组、BM组、BH组裸鼠原位移植瘤带瘤生存期分别为40.67±3.14、38.33±2.50、47.67±4.55、45.50±2.51、43.33±5.09天，BL组、BM组带瘤生存期与NS组相比较明显延长(P＜0.01或P＜0.05)；(4)HE染色显示蟾毒灵各剂量组移植瘤裸鼠的肝、肺、远端肠管病理形态与生理盐水组相比较无明显变化；5-Fu组和BM组、BH组原位移植瘤坏死面积与NS组相比较明显增加；(5)电镜显示蟾毒灵各剂量组可见单个的细胞凋亡结构，细胞核浓缩，染色质边集，或有规律的断裂成碎片，有核膜包裹形成新月形凋亡小体；TUNEL结果显示NS组、5-FU组和蟾毒灵BL、BM、BH组肿瘤细胞的凋亡指数分别为3.458±0.239、3.135±0.559、11.931±5.213、13.072±4.360、9.609±7.171，蟾毒灵各用药组肿瘤细胞凋亡指数明显高于NS组(P＜0.05)；(6)荧光定量PCR结果显示蟾毒灵各剂量组Bcl-xLmRNA的相对表达均明显低于NS组(P＜0.05)，且随剂量增加表达逐渐降低:蟾毒灵各剂量组Bax、Caspase-3mRNA的相对表达明显高于NS组(P＜0.05)，5-FU组基因Bcl-xL、Bax、Caspase-3mRNA表达与NS组比较无明显差异(P＞0.05)；(7)免疫组织化学方法和Western-bloting方法检测半定量统计显示蟾毒灵各剂量组Bcl-xL蛋白的表达强度与生理盐水组相比较明显下调(P＜0.01或P＜0.05)，而Bax、Caspase-3蛋白的表达与生理盐水组相比较明显上调(P＜0.01或P＜0.05).
结论：(1)不同剂量蟾毒灵能够不同程度抑制裸鼠大肠癌原位移植瘤的生长，延长裸鼠的带瘤生存期，促进原位移植瘤细胞的凋亡；(2)蟾毒灵抑制裸鼠大肠癌原位移植瘤的生长机制与下调凋亡相关基因Bcl-xL的表达，同时上调基因Bax、Caspase-3的表达有关。