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血管平滑肌细胞(VSMCs)是构成血管壁中层的主要细胞成分,而血管平滑肌细胞的增殖肥大又是高血压、动脉粥样硬化等多种血管增殖性疾病共同的细胞病理基础之一。研究表明在介导VSMCs增殖肥大中起主要作用的是G蛋白偶联受体通路、酪氨酸蛋白激酶(TPK)通路、整合素介导的信号转导通路和转化生长因子(TGF-β)/Smad通路。此外,还存在着许多已知和未知的信号通路,它们在多个层次上发生交互调节,构成复杂的细胞信号转导网络,共同决定细胞的生物学行为。人们以上皮细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞等为研究对象时,发现TGF-β/Smad与ERK信号转导通路在多个环节存在相互调节关系,在VSMC中这两条通路是否存在着类似的相互调节关系及其它们之间发生交互调节的具体环节和分子机制目前还不清楚,未见报道。
目的：在原代培养的大鼠胸主动脉平滑肌细胞基础上,通过施加转化生长因子TGF-β1及ERK阻断剂(PD98059),研究它们对血管平滑肌细胞增殖的影响,阐明TGF-β/Smad与ERK信号转导通路是否存在相互调节关系及发生交互调节的具体环节和分子机制。
方法：原代培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞并做a-平滑肌肌动蛋的(a-Actin)相关抗原鉴定,取3～5代细胞,MTT法检测不同浓度TGF-β(0、0.01、0.1、1、10ng/mL)、不同作用时间(0、8、12、16、20、24h)对大鼠平滑肌细胞增殖的影响,确定TGF-β1作用浓度和时间,然后分四组：对照组,TGF-β1组,ERK阻断剂(PD98059)组和TGF-β1+ERK阻断剂(PD98059)组。继续培养24小时后,用MTT法测细胞的增殖活性,Western-blot法检测VSMC中细胞内核增殖抗原(PCNA)、Smad2/3、ERK1/2、Smad7蛋白表达及磷酸化ERK1/2、磷酸化Smad2/3蛋白含量,RT-PCR方法测VSMC中Smad2、Smad3、Smad7mRNA的表达。
结果：
(1)与对照组相比,TGF-β1浓度≥1 ng/ml,作用24小时时A值明显降低,10ng/mlTGF-β1作用时间≥12 h时A值明显降低,呈浓度依赖和时间依赖方式抑制体外培养的血管平滑肌细胞的增殖。
(2)与对照组相比,其他各组PCNA蛋白表达和MTT法测得A值均降低,与TGF-β1组相比,ERK阻断剂组PCNA蛋白表达和MTT法测得A值显著降低,TGF-β1+ERK阻断剂组无差异。
(3)与对照组相比,TGF-β1组P-ERK1/2蛋白含量增多,ERK阻断剂组P-ERK1/2蛋白含量减少,TGF-β1+ERK阻断剂组P-ERK1/2蛋白含量无差异；与TGF-β1组相比,ERK阻断剂组和TGF-β1+ERK阻断剂组P-ERK1/2蛋白含量减少。各组间ERK1/2蛋白表达无差异。
(4)与对照组相比,TGF-β1组P-Smad2/3蛋白含量和Smad7蛋白表达增多,ERK阻断剂组P-Smad2/3蛋白含量和Smad7蛋白表达减少,TGF-β1+ERK阻断剂组P-Smad2/3蛋白含量和Smad7蛋白表达无差异；与TGF-β1组相比,ERK阻断剂组和TGF-β1+ERK阻断剂组P-Smad2/3蛋白含量和Smad7蛋白表达减少。各组间Smad2/3蛋白表达无差异。
(5)与对照组相比,TGF-β1组Smad7 mRNA表达增多,ERK阻断剂组和TGF-β1+ERK阻断剂组Smad7 mRNA表达减少；与TGF-β1组相比,ERK阻断剂组和TGF-β1+ERK阻断剂组Smad7mRNA表达减少。各组内VSMC的Smad2、Smad3 mRNA表达无差异。
结论：
(1)TGF-β1诱导的Smad2/3蛋白磷酸化依赖ERK通路激活,但对TGF-β1的抑制平滑肌细胞增殖的作用无影响,可能有其它信号通路参与此过程。
(2)ERK通路可通过蛋白和mRNA水平促进Smad7表达,反过来其又可促进ERK通路激活。
(3)ERK通路对Smad2/3蛋白和mRNA水平无影响。