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牛结核病(bovine tuberculosis)主要由分枝杆菌属牛分支杆菌(Mycobacteriumbovis)引起的一种人畜共患的慢性消耗性疾病，在世界多个国家流行。牛分支杆菌、鸟分支杆菌(M.avium)、结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)同为动物结核病病原，引起的病变非常相似，临床上难以进行区分。本实验为进一步区分三种分支杆菌，首先建立了以不同特异片段为靶基因的多重PCR快速检测方法。在优化条件后，对该方法的灵敏度、特异性及重复性进行了评价，并进行了临床样本的检测。同时，本研究还针对牛分支杆菌TbD1片段建立了超分支滚环扩增(HyperbranchedRolling circle amplification，HRCA)检测方法，对超分支滚环扩增技术在牛结核病检测中的应用和推广进行了尝试。通过对临床样本进行检测，对实验进行了论证。 主要研究内容如下： 1、首先通过对GeneBank公布的鸟分支杆菌16-23S rDNA(internal transcribedspacer，ITS)序列、牛分支杆菌的moaB3序列以及结核分支杆菌的RD10序列分析后，确定此三个片段具有菌种特异性，选定为目的基因，通过Primer5设计三对引物，以鸟分支杆菌标准株、牛分支杆菌标准株(AF2122/97)、结核分支杆菌标准株(H37Rv)基因组为模板进行菌液PCR，将PCR产物连接pMD-18T载体。童组质粒经测序鉴定正确，在单一PCR的基础上建立多重PCR方法。确定了在体系最性引物对比例M.tb：M.b：M.a为3:1:4，引物对浓度分别为1.2μM、0.4μM、1.6μM；退火温度为65℃，Mg2+浓度为2mM的最佳反应条件下，多重PCR方法对牛分支杆菌的检测限达到103copies/μL的靶分子，对结核分支杆菌和鸟分支杆菌的检测限达到104 copies/μL的靶分子。该多重PCR有良好的特异性和重复性，并对实验室保存的经基因芯片方法和real-time PCR方法检测的牛血液样本进行了验证，两种方法得出的检测结果基本相符。综上，我们建立的多重PCR方法可以实现一个反应中几种相似病原菌的确定，简单实用，有很好的临床推广前景。 2、以牛分支杆菌特异片段TbD1为靶序列建立了滚环扩增检测方法。利用Primer5及Oligo软件，以GeneBank公布的牛分支杆菌TbD1序列设计了PCR扩增引物、探针杂交区，利用随机序列设计了探针链接区和RAM扩增引物。以灭活菌液为模板，扩增出TbD1条带，将扩增产物克隆到pMD-18T载体，重组质粒鉴定为阳性。以阳性质粒为模板进行PCR扩增，胶回收后作为滚环扩增反应的模板。经过条件优化后，确定最佳反应条件为：在200pM的探针浓度下进行热循环连接；水解体系采用核酸外切酶Ⅰ5U、核酸外切酶Ⅲ5U，水解时间1h；滚环扩增体系加入引物浓度为2.5μM，4U的Bst DNA大片段聚合酶，在65℃进行滚环扩增反应。结果显示，该方法有良好的特异性和敏感性，滚环扩增反应体系灵敏度到达100个拷贝的靶分子，检测结果与普通PCR及基因芯片方法及荧光定量PCR方法相符合。该方法在病原检测中有十分巨大的潜力和推广前景，为下一步新的分子诊断学试剂盒以及多通路的新芯片检测技术奠定了良好的基础。