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目的: 观察蟾毒灵（Bufalin，Buf)对人高转移潜能肝癌细胞HCC-LM3自噬作用的影响，利用分子生物学技术探讨PI3K/AKT/mTOR信号通路在蟾毒灵影响肝癌细胞自噬作用中生物学作用，揭示蟾毒灵调控肝癌细胞自噬作用的分子机制，为蟾毒灵更好地应用于肝细胞癌及侵袭转移的防治及其相关分子靶向药物的研发提供新的理论基础。 方法: 1)体外培养人高转移潜能肝癌细胞HCC-LM3，依据实验要求分为6组:培养基对照组、Buf组、5-FU组、Buf+3MA组、Buf+CQ组、Buf+3MA+CQ组。 2)通过CCK实验观察蟾毒灵和5-FU对肝癌细胞的增殖抑制作用。 3)通过Transwell侵袭转移实验、粘附实验观察蟾毒灵联合自噬抑制剂对肝癌细胞迁移、侵袭和粘附能力的影响。 4)通过吖啶橙荧光染色法、流式细胞术、透射电子显微镜技术检测蟾毒灵联合自噬抑制剂对肝癌细胞HCC-LM3自噬体形成的影响。 5)通过Western Blot技术检测蟾毒灵联合自噬抑制剂作用肝癌细胞HCC-LM3后对细胞自噬相关蛋白LC3、LC3-Ⅱ、P62和Beclinl表达的影响。 6)通过Western Blot技术检测蟾毒灵联合自噬抑制剂作用肝癌细胞HCC-LM3后对细胞自噬相关PI3K/AKT/mTOT信号通路的影响。 结果: 1)蟾毒灵抑制肝癌细胞增殖具有时间、浓度双重依赖性，同等浓度情况下蟾毒灵对肝癌细胞抑制作用强于5-FU(F=26.00，P＜0.05)。 2)蟾毒灵作用HCC-LM3肝癌细胞24h的IC30、 IC50、IC70分别为0.04μg/ml、0.12μg/ml、0.41μg/ml(F=22.89，P＜0.05)，而5-FU作用HCC-LM3肝癌细胞24h的IC30、 IC50、 IC70分别为56.69μg/ml、186.31μg/ml、728.31μg/ml（F=42.55，P＜0.05）。 3)蟾毒灵作用HCC-LM3肝癌细胞24h后，与对照组相比，蟾毒灵显著抑制肝癌细胞的迁移、侵袭和粘附(F=48.37，F=27.89，F=107.04，P＜0.05);联合自噬抑制剂后，蟾毒灵对HCC-LM3肝癌细胞迁移、侵袭和黏附能力的抑制作用显著增强(F=48.37，F=27.89，F=107.04，P＜0.05)，并具有时间、剂量双重依赖性。 4)蟾毒灵作用HCC-LM3肝癌细胞后，与对照组相比，蟾毒灵作用肝癌细胞后细胞自噬体及自噬溶酶体明显增多，荧光强度显著增强(F=24.58，P＜0.05);而加入自噬抑制剂后，肝癌细胞自噬体及自噬溶酶体明显减少，荧光强度显著减弱(F=24.58，P＜0.05);与Buf+3MA组相比，Buf+CQ组肝癌细胞荧光强度无显著差异(F=24.58，P＞0.05)。 5)药物作用HCC-LM3肝癌细胞后，结果发现蟾毒灵组肝癌细胞LC3-Ⅱ(F=4.97，P＜0.05)，P62蛋白表达下调(F=15.89，P＜0.05);与蟾毒灵组相比，蟾毒灵+3MA+CQ组肝癌细胞LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达明下调(F=4.97，F=5.33，P＜0.05)，P62明显上调(F=15.89，P＜0.05)。 6)蟾毒灵显著上调肝癌细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路中PTEN表达(F=5.55，P＜0.05)，抑制P-AKT表达(F=12.78，P＜0.05)，但对AKT蛋白表达无明显影响(F=0.40，P＞0.05)。蟾毒灵联合自噬抑制剂3MA、CQ作用后，肝癌细胞PTEN蛋白表达进一步增加(F=5.55，P＜0.05)，P-AKT蛋白表达抑制显著降低(F=12.78，P＜0.05)。 7)蟾毒灵显著抑制肝癌细胞cyclin D1、MMP-2、MMP-9、VEGF、caspase-9蛋白的达(F=5.58，F=5.47，F=16.45，F=6.58，F=6.39，P＜0.05)，上调E-cadherin蛋白表达(F=11.88，P＜0.05)。蟾毒灵联合自噬抑制剂3MA或CQ后，肝癌细胞cyclin D1、MMP-2、MMP-9、VEGF、caspase-9蛋白表达显著下调(F=5.58，F=5.47，F=16.45，F=6.58，F=6.39，P＜0.05)，E-cadherin蛋白表达显著上升(F=11.88，P＜0.05)。 结论: 1)蟾毒灵显著抑制肝癌细胞的增殖能力，且抑制作用呈剂量、时间双重依赖性。 2)蟾毒灵显著抑制肝癌细胞增殖、粘附、侵袭、转移能力，蟾毒灵联合自噬抑制剂3MA和CQ时，蟾毒灵对肝癌细胞增殖、粘附、侵袭、转移的抑制作用最为显著。 3)蟾毒灵通过上调自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1表达，下调LC3-Ⅰ、P62表达诱导肝癌细胞自噬。通过联合作用部位不同的自噬抑制剂，下调或上调肝癌细胞LC3-Ⅱ、Beclin-1、p62蛋白表达，显著抑制蟾毒灵诱导肝癌细胞自噬作用。 4)蟾毒灵通过调控肝癌细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路中P-AKT和PTEN的表达，抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路下游相关因子cyclin D1、caspase-9、MMP-2、MMP-9、VEGF表达，上调E-cadherin表达，逆转肝癌细胞EMT，增强肝癌细胞之间的同质性粘附能力，降低肝癌细胞迁移侵袭能力，抑制肝癌细胞血管新生，是蟾毒灵抗肝细胞癌及侵袭转移的重要机制之一。