新ω-转氨酶的挖掘、性质及其应用

来源 :中国科学院大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:gjj19901005
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手性胺类化合物在医药、食品和生命科学研究领域中具有重要的应用价值。其中,芳香族β-/γ-氨基酸是一些药物和混合肽的重要组成部分。与传统的化学合成方法相比,酶法合成手性胺类化合物具有绿色高效、立体选择性高的优势。ω-转氨酶催化的转氨反应是制备手性胺类化合物的重要方法之一,本文着重开展具有合成应用前景的ω-转氨酶的发现、催化性质及在芳香族β-/γ-氨基酸制备中的应用研究。  采用序列比对的方法,从基因数据库中获得了分别来自Burkholderia phytofirmansPsJN和Hydrogenophaga sp.PBC的两个新ω-转氨酶基因(分别简称为hbp和hss);将这两个基因表达在大肠杆菌BL21(DE3)中,利用镍柱亲和层析纯化获得了这两个酶,研究了其酶学性质和底物谱。结果表明,HBP和HSS均为同源二聚体,最适反应pH分别为8.0~8.5和7.5左右,最适反应温度为40℃左右和45~50℃; pH稳定性良好,两个酶在pH6.0~9.0室温处理24 h后,均能保持70%以上的活力;温度稳定性良好,HBP在<50℃处理20 min后,HSS在55℃以下处理20 min后,活力保持在90%以上。底物谱方面,HBP的底物谱比较窄,HSS的底物谱相对较宽。氨基供体方面,HBP和HSS均能作用于脂肪族和芳香族β-氨基酸;HSS还能作用于芳香族的胺类。氨基受体方面,两个酶均能作用于酮酸,包括γ-酮酸。详细研究了HBP对芳香族β-氨基酸(β-Phe)及对位取代衍生物的手性拆分;结果表明,HBP能够有效地拆分β-Phe及其衍生物,转化率均在50%左右,ee值均>99%,对rac-β-Phe的最高反应浓度为100 mmol/L。HSS不仅能够有效拆分rac-β-Phe,还能够不对称合成芳香族γ-氨基酸;以苯乙胺为氨基供体,4-羰基-4-苯基丁酸为氨基受体,尝试了4-氨基-4-苯基丁酸的不对称合成。  详细研究了3-羰基-3-苯基丙酸(一种β-酮酸)的稳定性,其分解速率与温度成正相关关系;在25℃的条件下,静止放置12h后,只有14%的3-羰基-3-苯基丙酸分解,表明当以β-Phe和丙酮酸为底物反应时,平衡极其偏向丙酮酸的推动力是该反应的热力学性质,不是3-羰基-3-苯基丙酸的分解。在200μl的反应体系中,底物反应1.0 mmol/L,290nm的紫外吸收增加0.76。基于此,我们建立了一种更加简捷快速的酶活测定方法——利用酶标仪测定反应体系的紫外吸收变化。  总之,本研究获得了两个新的ω-转氨酶,研究了其酶学性质和底物谱,并应用于β-/γ-氨基酸的酶法催化制备,为ω-转氨酶的后续应用研究和工业应用奠定了基础;建立了一种简捷快速的酶活测定新方法,为后续的研究提供了方法基础。
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