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目的:泛素是真核生物中普遍存在并在进化过程中高度保守的一类蛋白质,泛素-蛋白酶体系统是真核细胞内重要的蛋白质调控系统,参与调节细胞周期进程、细胞增生与分化,以及信号传导等多种细胞生理过程,因此细胞内蛋白质泛素化降解是蛋白质重要的转录后修饰方式之一。选取果蝇为研究模型研究泛素连接酶E3基因敲除后对果蝇的发育影响,建立CG4911基因敲除果蝇株。
方法:首先利用网络基础生物信息工具--SMART(simple modular architectureresearch tool)筛选果蝇基因组中潜在的泛素连接酶E3基因,并利用Loss-of-Fuction分析这些基因的作用。候选的E3基因利用ds-RNA介导的干扰使其沉默,观察果蝇成虫眼和翅膀的表现型,并用免疫荧光染色Wing disc观察细胞信号通路基因的表达情况。用连有这些基因的载体转染Hela细胞,染色后观察基因在细胞内的表达位置。最后以P转座因子为工具敲除基因,以便于进行更加深入的分析。
结果:通过SMART-工具筛选出200个潜在的泛素连接酶E3基因,经过RNAi筛选分析后确定了15个候选基因进行敲除。RNAi沉默CG4911后果蝇成虫表现为强烈的翅膀和眼缺陷;免疫荧光染色的结果显示Wg和Dpp的信号通路受到破坏。获得CG4911敲除果蝇本论文主要介绍其中之一的基因CG4911的工作。
结论:泛素连接酶E3基因通过调节各细胞信号通路发挥在果蝇发育中的调节
作用;基因CG4911可能通过对Dpp,wg信号通路的调节参与果蝇眼和翅膀的发育过程。CG4911敲除果蝇的获得为进一步对该基因的生物化学,分子生物学分析建立了基础。