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β-葡萄糖苷酶是纤维素酶系中的一种重要组成部分,在纤维素降解中起重要作用。针对目前日益严峻的化石能源危机,木质纤维素能源化利用成为关键。β-葡萄糖苷酶是纤维素复合酶系降解纤维素的限速步骤。因此需要筛选得到高产β-葡萄糖苷酶,以增强纤维素酶体系对纤维素的水解能力。
本研究从自然界和实验室保存菌株中筛选得到高产β-葡萄糖苷酶的菌株,对其发酵条件、酶学性质、酶的分离纯化方面进行分析研究,获得以下试验结果:
(1)从腐败的小麦秸秆和实验室保存的菌株中筛选得到高产β-葡萄糖苷酶的菌株,命名为B2,经菌落、孢子形态的观察和18s rDNA序列分析,确定是黑曲霉(Aspergillus niger)。
(2)对黑曲霉B2的发酵条件进行优化。在基础产酶培养基的基础上于30℃,200 r/min恒温摇床上,对碳源、氮源、发酵时间、装液量、无机盐的含量进行优化,确定最佳发酵产酶培养基为麸皮4%,尿素0.4%,KH2PO40.5%,MgSO4.7H2O0.04%,BaCl20.16%,CaCl20.05%,装液量为50mL/250 mL,发酵时间为5d。发酵条件优化后β-葡萄糖苷酶的酶活高达46.1U/mL,是优化前β-葡萄糖苷酶酶活的1.9倍。
(3)测定β-葡萄糖苷酶的酶学性质,得到最适pH值为4.5,最适温度为65℃,在pH值3.0~10.0之间较稳定;温度稳定性较好,在65℃保温120min后仍有61.6%的相对活性;终浓度为5 mmol·L-1的Fe2+和Mn2+对酶活性有较强的促进作用。
(4)β-葡萄糖苷的分离与纯化,将粗酶液经过80%饱和度的硫酸铵盐析得到的蛋白,过Sephadex G-25葡聚糖凝胶柱,Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱,DEAE-Sephadex A-50离子交换柱纯化后,得到的条带较少,经初步判断确定β-葡萄糖苷酶的相对分子量大约为116kDa左右,比活力达到68.51 U/mg,纯化了11.53倍,酶的总回收率为12.74%。
(5)β-葡萄糖苷酶对不同底物的酶解,用薄层层析法(TLC)对酶解产物进行分析。结果显示,纤维二糖、水杨苷、白藜芦醇苷和京尼平苷分别在20min、30min、30min、30min的时候被酶解完全。另外,β-葡萄糖苷酶还可以作用于梓醇。