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本试验研究柠檬桉的组织培养中外植体的植入,柠檬桉芽的继代繁殖和组培苗生根诱导的主要影响因素,还初步探讨了成年优树嫁接苗的外植体的植入流程,为柠檬桉组培技术进一步应用于生产提供依据。初步研究结果如下:
1.外植体植入灭菌流程
以1年生柠檬桉苗截顶后的萌芽条为材料,试验柠檬桉外植体植入的灭菌流程。柠檬桉外植体去毛后未能改善灭菌效果。上午采集的外植体和下午采集的外植体灭菌效果相差不大,而早上采集的出芽率较高,柠檬桉外植体可在早上采集。
0.1%升汞灭菌3min+2min的褐化率已达40%,而发芽率才3%。无法再进行长时间的灭菌。而0.1%升汞灭菌1min+1min,污染率和褐化率最低,发芽率最高,最高可达55%。
一年生柠檬桉外植体植入的最佳流程。用洗洁精漂洗2~3min,自来水清洗2~3次,然后用95%酒精浸泡材料10秒钟,自来水洗2~3次,在超净工作台内用2%的苯扎溴胺溶液漂洗材料20分钟,无菌水洗3次;用0.1%的升汞(加2~3滴吐温80)浸泡材料1分钟,无菌水洗3次;然后再次用0.1%的升汞(加2~3滴吐温80)再浸泡材料1分钟,无菌水洗5-6次。
还对成年优树嫁接苗做了初步研究,灭菌效果为污染率低而褐化率高,表明灭菌时间还可以缩短。柠檬桉优树L48的出芽率达到14.29%和16.67%,说明优树外植体植入是成功的。但是优树的外植体植入的最佳流程还需进一步研究。
2.继代培养
对影响继代芽增殖的基本培养基,基本培养基大量元素浓度,BA和NAA浓度,有效芽长度及继代周期这几个因素进行试验。
DCR基本培养基的芽倍增率明显高于其他两种培养基,芽倍增率可达6.1174。较低的NH4+、NO3-和K+,较高的Ca2+有利于柠檬桉继代芽的增殖。3/2倍~2倍的DCR大量元素,有利于芽的伸长。BA浓度为2mg/L对芽增殖的效果最好;高浓度NAA不利于芽的增殖,以低于0.1mg/L为佳。
柠檬桉继代培养培养基为:DCR2倍大量元素+1倍微量元素+1倍有机盐+1倍铁盐+蔗糖20g/L+肌醇100mg/L+BA2mg/L+NAA0.05mg/L,pH=5.8。
5~10mm的柠檬桉芽,其褐化率12.65%,与10mm以上的柠檬桉芽的褐化率(1.14%)差异不显著。5mm以上的芽褐化率在生产上为可接受的范围,所以建议用5mm以上的柠檬桉芽继代。
用果酱瓶继代,枯芽数和三角瓶差异不显著,其枯芽率最大也只有10.2%。在生产上可以接受。生产上考虑到成本的问题,建议用果酱瓶进行继代培养。在二个月后,柠檬桉芽就开始慢慢的枯死。最大的达24.7%。柠檬桉苗在继代1个月后,就要继续继代。
3.生根诱导
对影响柠檬桉组培苗生根诱导的基本培养基浓度,糖浓度,IBA和NAA浓度这几个因素进行试验。
DCR培养基是最适合进行生根诱导的培养基,生根率达70.8%。较低的NH4+、N03-和K+,较高的Ca2+有利于柠檬桉组培苗根的诱导。柠檬桉的生根诱导中,糖浓度为10~20g/L时,生根率显著高于糖浓度为30g/L。生根诱导生长素浓度为IBA0.5~1.0mg/L和NAA0.01~0.1mg/L。生根诱导培养基配方为:DCR1大量元素+1倍微量元素+1倍有机物盐+1倍铁盐+蔗糖20g/L+肌醇100mg/L+IBA0.5mg/L+NAA0.01mg/L,pH=5.8。