N-糖基化是重要的蛋白质翻译后修饰之一,通过共价键结合到蛋白质上的N-寡糖除了辅助新翻译的多肽链正常折叠外,还具有维持蛋白结构稳定与活性、介导细胞之间信息传导等功能。在人体中,几乎所有的细胞表面糖蛋白和分泌蛋白都是复合型N-糖链修饰的糖蛋白,这意味着复合型N-糖链修饰对人源蛋白有不可替代的作用。为深入研究糖链与蛋白之间的相互作用与影响,需要在体外获得大量均一的复合型N-糖链修饰的蛋白。现阶段,除了在真核细胞中对糖链加工系统进行基因编辑以控制其糖基化路径以得到目标糖蛋白的方法外,化学法合成糖链与肽段并进行偶连也是获得均一糖链修饰糖蛋白的一种较为可行的方法。本论文中,拟采用化学酶法开发从下向上组装复合型N-糖链。首先开发大量表达糖基转移酶的原核表达体系,用得到的糖基转移酶,以化学合成的脂肪链连接的N-乙酰壳二糖为初始底物,进行糖链逐步组装,随后用超高效液相色谱-质谱联用的方法检测反应进程,并对糖链结构进行鉴定;同时,对该合成路径中所需的要的、初次获得的截除N-端跨膜域结构的人源重组GnT-I和GnT-II蛋白进行了表达条件的优化与性质表征。结果表明,实验中成功共表达了酵母Alg1、Alg2,表达并纯化了人源GnT-I,GnT-II,β4GalT1等糖基转移酶,并利用这些酶从下向上逐步组装糖链得到了典型的双天线复合型N-糖链结构Gal2Gn2Man3Gn2,产量可达毫克级别。同时对人源GnT-I,GnT-II蛋白性质进行了研究,结果表明杂合型/复合型糖链合成路径中的起始蛋白GnT-I具有较低的底物特异性,可以识别非天然底物Man3Gn2,在pH 6.0的环境中以转化率100%生产GnMan3Gn2结构;而GnT-II蛋白底物特异性较高,对底物糖链左边天线上N-乙酰葡糖胺残基有选择性,并要求反应环境中存在Mn²⁺或Co²⁺。重组GnT-II蛋白测得的Km值为55μM,与文献报道的利用昆虫细胞表达的蛋白Km值十分相近,证明该体系表达的蛋白与天然蛋白性质一致。本论文成功开发了从下向上利用酶法组装双天线复合型N-寡糖的体系,得到了高产率、高收率的组装方法,并对组装路径所涉及的关键蛋白进行了性质分析。论文中开发的原核表达系统,体外酶促反应条件等后续可应用于其他相关蛋白的表达;获得的各种糖基转移酶可应用于各种糖链的体外组装;制备的复合型N-糖链为后续的寡糖基转移酶反应提供了原料,为进一步开发合成均一复合型N-糖链糖蛋白打下了基础。