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p62，别名sequestosome-1，是细胞自噬通路上的一个非常重要的受体蛋白。p62含有的多个功能结构域使之成为细胞多个信号通路的中心环节，能够介导蛋白聚集体、病毒衣壳蛋白、可溶性蛋白、入侵的细菌以及细菌前体通过细胞自噬进行降解。前期研究发现，在细胞中过表达家蚕p62（SilkDB：BGIBMGA002620-PA）后，再感染BmNPV T3株，将导致polyhedrin表达量降低，呈现多角体的细胞数量也显著减少，表明宿主细胞表达的p62可一定程度上限制BmNPV的感染。ref(2)P是家蚕p62的一个旁系同源蛋白，两蛋白有相似的生物学特性。本论文对家蚕p62在大肠杆菌中的表达、p62与polyhedrin之间的结合、ref(2)P形成聚集体（inclusion body，IB）的分子基础进行了初步的研究。主要结果如下所述。
1.p62在大肠杆菌细胞中成功表达与p62多克隆抗体的制备
在载体pET-30a的基础上，将p62融合在eGFP的C-末端，构建表达融合蛋白eGFP-p62的载体。转化大肠杆菌BL21（DE3）后，使用不同浓度的IPTG进行诱导。SDS-PAGE和考马斯亮蓝分析显示，eGFP-p62高效表达。纯化eGFP-p62，制备了p62的鼠源多克隆抗体。
2.家蚕p62、ref(2)P的特性
以人类p62（NP_003891.1）的氨基酸序列为搜索序列，在NCBI上对家蚕蛋白质数据库进行BLASTP分析。家蚕p62基因（NCBI GeneID：101736823）的蛋白产物有2个：p62（protein_id：XP_004932349.1）和ref(2)P（protein_id：XP_012551153.1）。从氨基酸序列上看，与p62相比，ref(2)P不含PB1结构域，但两蛋白的其它氨基酸序列（包含ZZ、LIR、UBA等结构域）是完全一致的，表明p62与ref(2)P的分子生物学特性有差异，也有共性。
构建p62、ref(2)P的瞬时表达载体，并融合在eGFP或mCherry的C-末端，转染家蚕细胞后，用激光共聚焦显微镜进行观察。实验发现，在BmN细胞中单独表达eGFP-p62、eGFP-ref(2)P时，p62、ref(2)P在细胞质中形成聚集体。这种聚集体被称为IB。当mCherry-p62与eGFP-ref(2)P共表达时，p62与ref(2)P在细胞质中共定位且形成IB。
3.p62、ref(2)P形成IB的机理研究
构建ref(2)P的两个氨基酸簇（M1、M2）中的多个疏水性氨基酸的多重点突变体，与eGFP融合并转染家蚕细胞，48h后用激光共聚焦显微镜进行观察。实验发现，突变体eGFP-ref(2)P(M1-A)，eGFP-ref(2)P(M2-A)在细胞质中形成的IB数量明显减少；突变M1、M2内的全部疏水性氨基酸，在绝大多数被转染的BmN细胞中，eGFP-ref(2)P(M1/M2-A)在细胞质中不能形成IB而变得弥散。由于M1、M2区域多为疏水性氨基酸，结合对这两个区域的三维空间结构的分析，推测家蚕ref(2)P通过M1、M2区域疏水性氨基酸之间的结合形成IB。
构建p62M1和M2双突变体eGFP-p62(M1/M2-A)，转染BmN细胞，激光共聚焦显微镜仍能观察IB的形成。参考人类p62IB生成的关键性氨基酸K7和D69，突变家蚕对应的氨基酸K8和D59，构建eGFP-p62(K8/D59/M1/M2-A)的瞬时表达载体。激光共聚焦显微镜观察到绝大部分被转染的BmN细胞中无IB生成且荧光变得弥散。得出结论：家蚕p62IB形成的途径可能有两个，即M1、M2区域的疏水作用，以及K8、D59之间的静电作用。M1区域在人类p62中不存在，结合已经报道的文献，认为人类p62与家蚕p62形成IB的机理是不完全相同的。
4.polyhedrin与p62/ref(2)P结合区域初探
(1)在对ref(2)P结构域分析基础上，构建一系列截短突变体，并与polyhedrin-mCherry共表达。尽管polyhedrin是一个含有核定位信号的蛋白，但当与ref(2)P或p62共表达后，部分polyhedrin-mCherry与eGFP-ref(2)P（或eGFP-p62）共定位且在细胞质中形成IB。
构建ref(2)P结构域UBA缺失的突变体，与polyhedrin-mCherry共表达后，激光共聚焦显微镜观察到eGFP-ref(2)P(ΔUBA)主要分布于细胞质，而polyhedrin-mCherry主要定位于细胞核中；两融合蛋白不能共定位，且没有在细胞质内形成IB。当eGFP-ref(2)P(M2-A)与polyhedrin-mCherry共表达后，也得到了类似的实验结果。这些结果表明，ref(2)P通过UBA结构域内的M2氨基酸簇与polyhedrin结合。
(2)构建polyhedrin的一系列截短突变体，polyhedrin(1-28)、polyhedrin(1-63)、polyhedrin(1-95)、polyhedrin(1-112)、polyhedrin(1-129)、polyhedrin(1-189)、polyhedrin(1-211)和polyhedrin(1-232)。与eGFP融合后进行瞬时表达，激光共聚焦显微镜观察到polyhedrin(1-28)、polyhedrin(1-63)、polyhedrin(1-95)、polyhedrin(1-112)、polyhedrin(1-129)和polyhedrin(1-232)主要分布于细胞核内，而polyhedrin(1-189)和polyhedrin(1-211)却定位于细胞质中且形成了IB。将这些截短突变体与p62共表达，激光共聚焦显微镜发现这些截短突变体与p62共定位，且在细胞质中形成IB。polyhedrin(1-28)是目前已知可与p62结合的最短肽段。
1.p62在大肠杆菌细胞中成功表达与p62多克隆抗体的制备
在载体pET-30a的基础上，将p62融合在eGFP的C-末端，构建表达融合蛋白eGFP-p62的载体。转化大肠杆菌BL21（DE3）后，使用不同浓度的IPTG进行诱导。SDS-PAGE和考马斯亮蓝分析显示，eGFP-p62高效表达。纯化eGFP-p62，制备了p62的鼠源多克隆抗体。
2.家蚕p62、ref(2)P的特性
以人类p62（NP_003891.1）的氨基酸序列为搜索序列，在NCBI上对家蚕蛋白质数据库进行BLASTP分析。家蚕p62基因（NCBI GeneID：101736823）的蛋白产物有2个：p62（protein_id：XP_004932349.1）和ref(2)P（protein_id：XP_012551153.1）。从氨基酸序列上看，与p62相比，ref(2)P不含PB1结构域，但两蛋白的其它氨基酸序列（包含ZZ、LIR、UBA等结构域）是完全一致的，表明p62与ref(2)P的分子生物学特性有差异，也有共性。
构建p62、ref(2)P的瞬时表达载体，并融合在eGFP或mCherry的C-末端，转染家蚕细胞后，用激光共聚焦显微镜进行观察。实验发现，在BmN细胞中单独表达eGFP-p62、eGFP-ref(2)P时，p62、ref(2)P在细胞质中形成聚集体。这种聚集体被称为IB。当mCherry-p62与eGFP-ref(2)P共表达时，p62与ref(2)P在细胞质中共定位且形成IB。
3.p62、ref(2)P形成IB的机理研究
构建ref(2)P的两个氨基酸簇（M1、M2）中的多个疏水性氨基酸的多重点突变体，与eGFP融合并转染家蚕细胞，48h后用激光共聚焦显微镜进行观察。实验发现，突变体eGFP-ref(2)P(M1-A)，eGFP-ref(2)P(M2-A)在细胞质中形成的IB数量明显减少；突变M1、M2内的全部疏水性氨基酸，在绝大多数被转染的BmN细胞中，eGFP-ref(2)P(M1/M2-A)在细胞质中不能形成IB而变得弥散。由于M1、M2区域多为疏水性氨基酸，结合对这两个区域的三维空间结构的分析，推测家蚕ref(2)P通过M1、M2区域疏水性氨基酸之间的结合形成IB。
构建p62M1和M2双突变体eGFP-p62(M1/M2-A)，转染BmN细胞，激光共聚焦显微镜仍能观察IB的形成。参考人类p62IB生成的关键性氨基酸K7和D69，突变家蚕对应的氨基酸K8和D59，构建eGFP-p62(K8/D59/M1/M2-A)的瞬时表达载体。激光共聚焦显微镜观察到绝大部分被转染的BmN细胞中无IB生成且荧光变得弥散。得出结论：家蚕p62IB形成的途径可能有两个，即M1、M2区域的疏水作用，以及K8、D59之间的静电作用。M1区域在人类p62中不存在，结合已经报道的文献，认为人类p62与家蚕p62形成IB的机理是不完全相同的。
4.polyhedrin与p62/ref(2)P结合区域初探
(1)在对ref(2)P结构域分析基础上，构建一系列截短突变体，并与polyhedrin-mCherry共表达。尽管polyhedrin是一个含有核定位信号的蛋白，但当与ref(2)P或p62共表达后，部分polyhedrin-mCherry与eGFP-ref(2)P（或eGFP-p62）共定位且在细胞质中形成IB。
构建ref(2)P结构域UBA缺失的突变体，与polyhedrin-mCherry共表达后，激光共聚焦显微镜观察到eGFP-ref(2)P(ΔUBA)主要分布于细胞质，而polyhedrin-mCherry主要定位于细胞核中；两融合蛋白不能共定位，且没有在细胞质内形成IB。当eGFP-ref(2)P(M2-A)与polyhedrin-mCherry共表达后，也得到了类似的实验结果。这些结果表明，ref(2)P通过UBA结构域内的M2氨基酸簇与polyhedrin结合。
(2)构建polyhedrin的一系列截短突变体，polyhedrin(1-28)、polyhedrin(1-63)、polyhedrin(1-95)、polyhedrin(1-112)、polyhedrin(1-129)、polyhedrin(1-189)、polyhedrin(1-211)和polyhedrin(1-232)。与eGFP融合后进行瞬时表达，激光共聚焦显微镜观察到polyhedrin(1-28)、polyhedrin(1-63)、polyhedrin(1-95)、polyhedrin(1-112)、polyhedrin(1-129)和polyhedrin(1-232)主要分布于细胞核内，而polyhedrin(1-189)和polyhedrin(1-211)却定位于细胞质中且形成了IB。将这些截短突变体与p62共表达，激光共聚焦显微镜发现这些截短突变体与p62共定位，且在细胞质中形成IB。polyhedrin(1-28)是目前已知可与p62结合的最短肽段。