土壤中纤维素降解真菌的筛选及其纤维素酶活性的研究

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本实验从秸秆还田的土壤中分离并筛选出能分解纤维素的真菌。经过富集培养和刚果红平板初筛法筛选分离降解纤维素的真菌,通过形态学观察和18S-ITS-5.8S基因序列的分析对分离的菌株进行初步鉴定。然后选取刚果红平板上水解圈直径与菌落直径比值大的菌株进行发酵培养基优化实验,并研究其酶学性质。  利用CMC-Na培养基对初步筛选的能产纤维素酶的真菌进行复筛,共分离得到25株真菌,将筛选得到的25株能降解纤维素的真菌进行形态学观察和分子学鉴定,结果显示其分别属于格孢腔菌属(Phaeosphaeria sp.,4株),枝孢属(Cladosporium sp.,5株),派伦霉属(Peyronellaea sp.,1株),曲霉属(Aspergillus sp.,7株),小球腔菌属(Leptosphaeria sp.,2株),青霉属(Penicillium sp.,4株),纠缠青霉属(Penicillium implicatum sp.,1株),赤霉属(Gibberella sp.,1株)。  通过进一步的筛选,观察菌株在刚果红培养基上水解圈(水解圈直径/菌落直径)的大小,获得1株高活性纤维素降解真菌,通过形态学和分子生物学初步鉴定其为一株格孢腔菌,初步命名为Phaeosphaeria sp. XJ-25。筛选得到的能降解纤维素的真菌中,菌株XJ-25具有较强的纤维素酶活力,通过液体发酵实验,研究了碳源的不同、氮源的不同、发酵的时间的差异、培养基初始pH的选择、初始发酵的温度的选择、接种量的不同、通气量的大小等单因素条件对格孢腔菌产酶高低的影响,结果得出该菌产纤维素酶的最适碳源是玉米秸秆粉与麸皮的按照9:1比例进行混合,最佳氮源是尿素,最佳发酵的时间为96 h,培养基的初始pH选择3,初始发酵温度选择28℃,接种量是4%,通气量是50 mL/150 mL。  在上述实验的基础上,选取碳源、氮源、培养基初始pH和接种量4个因素,通过响应面法设计4因素3水平实验对发酵产酶条件进行优化。经过条件优化,结果显示CMC酶活力达到最大的条件为:玉米秸秆粉1.34 g/L、麸皮0.16 g/L、尿素10.06 g/L、培养基初始pH3.25、接种量4.13%,CMC酶活达到23.871 U/mL。FPA酶活力达到最大的发酵条件为:1.34 g/L的玉米秸秆粉、0.16g/L的麸皮、10.12 g/L的尿素、培养基初始pH3.41、4.22%的接种量,FPA酶活力为8.653U/mL。在酶与底物的反应中最适反应温度为50℃,酶液的热稳定性较差,当温度低于40℃,酶活力可以保持稳定。在酶反应中最适反应pH为5,酶活性在pH4-6的范围内比较稳定。
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