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目的：基于“脾肾相关”理论，以不同治法干预尾吊大鼠，考察健脾方药、补肾方药和补肾健脾方药对尾吊大鼠骨丢失的防治作用，并揭示其分子机制，从而探索防治废用性骨质疏松症的作用机制。
材料与方法：SPF级，健康Wistar大鼠，体质量(200±20)g，2月龄，雄性，50只。所有大鼠先适应性喂养之后，依据体重分层后按每组10只随机进行分组，分成空白对照组、尾吊组、健脾组、补肾组、补肾健脾组。将尾吊组、健脾组、补肾组、补肾健脾组大鼠采用尾部悬吊法造模。以人与大鼠体表面积比换算出的等效剂量给予中药药液。从实验第1天开始对中药干预的各组大鼠予以相应健脾方、补肾方、补肾健脾方灌胃，空白对照组与尾吊组用相同体积无菌蒸馏水灌胃。每天灌胃1次，于实验第28天进行最后一次灌胃，称量并记录大鼠体重，灌胃2h后取材。处死大鼠的方式采用麻醉过量致死。无菌环境下取大鼠的双侧股骨和胫骨，将骨骼周围附着的软组织及肌肉剔除干净。称量大鼠双侧股骨和胫骨重量，计算双侧股骨和胫骨与体重的比值。检测大鼠右侧股骨和胫骨BMD和骨矿含量；三点弯曲实验检测大鼠股骨和胫骨生物力学和结构力学性能；HE染色法检测大鼠胫骨干骺端骨小梁形态；WesternBlot法检测大鼠胫骨内ALP、SPARC、ATF4、β-catenin、DKK1、Kremen2、SFRP2蛋白表达量。
结果：
1各组大鼠胫骨体重比和股骨体重比的变化情况
与空白对照组比，尾吊组大鼠的胫骨体重比和股骨体重比显著降低(P<0.01)；与尾吊组比，健脾组、补肾组大鼠的胫骨体重比和股骨体重比升高(P<0.05)，补肾健脾组大鼠的胫骨体重比和股骨体重比显著升高(P<0.01)；与补肾健脾组比，补肾组和健脾组大鼠的胫骨体重比和股骨体重比降低(P<0.05)。
2各组大鼠胫骨和股骨BMD的变化情况
与空白对照组比，尾吊组大鼠的胫骨和股骨BMD显著降低(P<0.01)；与尾吊组比，补肾组、健脾组大鼠的胫骨和股骨BMD升高(P<0.05)，补肾健脾组大鼠的胫骨和股骨BMD显著升高(P<0.01)；与补肾健脾组比，补肾组和健脾组大鼠的胫骨和股骨BMD降低(P<0.05)。
3各组大鼠胫骨干骺端骨小梁微结构的变化情况
空白对照组大鼠的松质骨部位骨小梁粗壮、饱满，紧密、整齐、规则地排列并连接成网状，骨小梁形态结构完整，骨髓腔大小正常；与空白对照组比，尾吊组大鼠骨松质部位的骨小梁总量明显减少，骨小梁明显变细，结构紊乱稀疏，连接性差，出现大量骨小梁断端，有扭曲，形态结构差，骨小梁间的间隙增大，骨髓腔扩大融合明显，骨髓腔增大；各给药组治疗28天后，和尾吊组比较，补肾健脾组较健脾组、补肾组改善效果好，骨小梁变粗、增宽，骨小梁数目增多，小梁间连接性与完整性改善，排列较紧密规则，骨髓腔大小较正常。
4各组大鼠股骨生物力学和结构力学的变化情况
4.1各组大鼠股骨力学性能的变化情况
与空白对照组比，尾吊组大鼠股骨最大应力、抗弯强度降低(P<0.05)，断裂力显著降低(P<0.01)；与尾吊组比，健脾组大鼠股骨最大应力、抗弯强度升高(P<0.05)，补肾组和补肾健脾组大鼠股骨最大应力、抗弯强度、断裂力升高(P<0.05)；与补肾健脾组比，健脾组和补肾组大鼠股骨最大应力、抗弯强度、断裂力降低(P<0.05)。
4.2各组大鼠胫骨力学性能的变化情况
与空白对照组比，尾吊组大鼠胫骨最大应力、抗弯强度、断裂力降低(P<0.05)；与尾吊组比，补肾组大鼠胫骨抗弯强度升高(P<0.05)，健脾组和补肾健脾组大鼠胫骨最大应力、抗弯强度、断裂力升高(P<0.05)；与补肾健脾组比，补肾组大鼠胫骨最大应力、断裂力降低(P<0.05)。
5各组大鼠胫骨骨形成相关蛋白的变化情况
5.1各组大鼠胫骨ALP蛋白表达情况
与空白对照组比，尾吊组大鼠胫骨中ALP蛋白表达量显著降低(P＜0.01)。与尾吊组比，健脾组和补肾组大鼠胫骨中ALP蛋白表达量升高(P＜0.05)，补肾健脾组大鼠胫骨中ALP蛋白表达量显著升高(P＜0.01)；与补肾健脾组比，健脾组和补肾组大鼠胫骨中ALP蛋白表达量降低(P＜0.05)。
5.2各组大鼠胫骨SPARC蛋白表达情况
与空白对照组比，尾吊组大鼠胫骨SPARC蛋白表达量显著降低(P＜0.01)。与尾吊组比，健脾组和补肾组大鼠胫骨SPARC蛋白表达量升高(P＜0.05)，补肾健脾组大鼠胫骨SPARC蛋白表达量显著升高(P＜0.01)；与补肾健脾组比，健脾组和补肾组大鼠胫骨SPARC蛋白表达量降低(P＜0.05)。
5.3各组大鼠胫骨ATF4蛋白表达情况
与空白对照组比，尾吊组大鼠胫骨中ATF4蛋白表达量显著降低(P＜0.01)。与尾吊组比，健脾组和补肾组大鼠胫骨中ATF4蛋白表达量升高(P＜0.05)，补肾健脾组大鼠胫骨中ATF4蛋白表达量显著升高(P＜0.01)；与补肾健脾组比，健脾组和补肾组大鼠胫骨中ATF4蛋白表达量降低(P＜0.05)。
6各组大鼠胫骨经典Wnt信号通路相关蛋白的变化情况
6.1各组大鼠胫骨β-catenin蛋白表达情况
与空白对照组比，尾吊组大鼠胫骨β-catenin蛋白表达量显著降低(P＜0.01)；与尾吊组比，健脾组和补肾健脾组大鼠胫骨β-catenin蛋白表达量显著升高(P＜0.01)；与补肾健脾组比，补肾组大鼠胫骨β-catenin蛋白表达量降低(P＜0.05)。
6.2各组大鼠胫骨DKK1蛋白表达情况
与空白对照组比，尾吊组大鼠胫骨DKK1蛋白表达量显著升高(P＜0.01)；与尾吊组比，补肾组和补肾健脾组大鼠胫骨DKK1蛋白表达量显著降低(P＜0.01)；与补肾健脾组比，健脾组大鼠胫骨DKK1蛋白表达量升高(P＜0.05)。
6.3各组大鼠胫骨Kremen2蛋白表达情况
与空白对照组比，尾吊组大鼠胫骨Kremen2蛋白表达量显著升高(P＜0.01)；与尾吊组比，健脾组、补肾组和补肾健脾组大鼠胫骨Kremen2蛋白表达量降低(P＜0.05)；与补肾健脾组比，补肾组大鼠胫骨Kremen2蛋白表达量升高(P＜0.05)。
6.4各组大鼠胫骨SFRP2蛋白表达情况
与空白对照组比，尾吊组大鼠胫骨SFRP2蛋白表达量显著降低(P＜0.01)；与尾吊组比，补肾组和补肾健脾组大鼠胫骨SFRP2蛋白表达量显著升高(P＜0.01)；与补肾健脾组比，健脾组大鼠胫骨SFRP2蛋白表达量降低(P＜0.05)。
结论：
1基于“脾肾相关”理论，结合骨质疏松症的中医病因病机理论，采用补肾健脾方、补肾方和健脾方干预尾部悬吊大鼠骨丢失模型，发现三种治法均能够增加尾吊大鼠股骨和胫骨BMD、骨量，改善骨小梁微结构，对尾吊大鼠骨丢失具有改善作用，从而防治废用性骨质疏松症，以补肾健脾方为优。
2补肾健脾方、补肾方和健脾方均能够改善尾吊大鼠生物力学性能，降低骨质疏松性骨折发生的风险，以补肾健脾方为优。
3补肾健脾方、补肾方和健脾方干预尾吊大鼠骨形成的机制：通过增加骨形成早期蛋白ALP表达，相应的转录因子ATF4的表达，以及激活下游通路的SPARC、SFRP2蛋白的表达，减少通路拮抗剂DKK1和Kremen2的表达，激活经典Wnt信号通路，促进核心蛋白β-catenin入核表达，进一步促进下游转录调控骨形成，从而对抗尾吊导致的骨丢失。
材料与方法：SPF级，健康Wistar大鼠，体质量(200±20)g，2月龄，雄性，50只。所有大鼠先适应性喂养之后，依据体重分层后按每组10只随机进行分组，分成空白对照组、尾吊组、健脾组、补肾组、补肾健脾组。将尾吊组、健脾组、补肾组、补肾健脾组大鼠采用尾部悬吊法造模。以人与大鼠体表面积比换算出的等效剂量给予中药药液。从实验第1天开始对中药干预的各组大鼠予以相应健脾方、补肾方、补肾健脾方灌胃，空白对照组与尾吊组用相同体积无菌蒸馏水灌胃。每天灌胃1次，于实验第28天进行最后一次灌胃，称量并记录大鼠体重，灌胃2h后取材。处死大鼠的方式采用麻醉过量致死。无菌环境下取大鼠的双侧股骨和胫骨，将骨骼周围附着的软组织及肌肉剔除干净。称量大鼠双侧股骨和胫骨重量，计算双侧股骨和胫骨与体重的比值。检测大鼠右侧股骨和胫骨BMD和骨矿含量；三点弯曲实验检测大鼠股骨和胫骨生物力学和结构力学性能；HE染色法检测大鼠胫骨干骺端骨小梁形态；WesternBlot法检测大鼠胫骨内ALP、SPARC、ATF4、β-catenin、DKK1、Kremen2、SFRP2蛋白表达量。
结果：
1各组大鼠胫骨体重比和股骨体重比的变化情况
与空白对照组比，尾吊组大鼠的胫骨体重比和股骨体重比显著降低(P<0.01)；与尾吊组比，健脾组、补肾组大鼠的胫骨体重比和股骨体重比升高(P<0.05)，补肾健脾组大鼠的胫骨体重比和股骨体重比显著升高(P<0.01)；与补肾健脾组比，补肾组和健脾组大鼠的胫骨体重比和股骨体重比降低(P<0.05)。
2各组大鼠胫骨和股骨BMD的变化情况
与空白对照组比，尾吊组大鼠的胫骨和股骨BMD显著降低(P<0.01)；与尾吊组比，补肾组、健脾组大鼠的胫骨和股骨BMD升高(P<0.05)，补肾健脾组大鼠的胫骨和股骨BMD显著升高(P<0.01)；与补肾健脾组比，补肾组和健脾组大鼠的胫骨和股骨BMD降低(P<0.05)。
3各组大鼠胫骨干骺端骨小梁微结构的变化情况
空白对照组大鼠的松质骨部位骨小梁粗壮、饱满，紧密、整齐、规则地排列并连接成网状，骨小梁形态结构完整，骨髓腔大小正常；与空白对照组比，尾吊组大鼠骨松质部位的骨小梁总量明显减少，骨小梁明显变细，结构紊乱稀疏，连接性差，出现大量骨小梁断端，有扭曲，形态结构差，骨小梁间的间隙增大，骨髓腔扩大融合明显，骨髓腔增大；各给药组治疗28天后，和尾吊组比较，补肾健脾组较健脾组、补肾组改善效果好，骨小梁变粗、增宽，骨小梁数目增多，小梁间连接性与完整性改善，排列较紧密规则，骨髓腔大小较正常。
4各组大鼠股骨生物力学和结构力学的变化情况
4.1各组大鼠股骨力学性能的变化情况
与空白对照组比，尾吊组大鼠股骨最大应力、抗弯强度降低(P<0.05)，断裂力显著降低(P<0.01)；与尾吊组比，健脾组大鼠股骨最大应力、抗弯强度升高(P<0.05)，补肾组和补肾健脾组大鼠股骨最大应力、抗弯强度、断裂力升高(P<0.05)；与补肾健脾组比，健脾组和补肾组大鼠股骨最大应力、抗弯强度、断裂力降低(P<0.05)。
4.2各组大鼠胫骨力学性能的变化情况
与空白对照组比，尾吊组大鼠胫骨最大应力、抗弯强度、断裂力降低(P<0.05)；与尾吊组比，补肾组大鼠胫骨抗弯强度升高(P<0.05)，健脾组和补肾健脾组大鼠胫骨最大应力、抗弯强度、断裂力升高(P<0.05)；与补肾健脾组比，补肾组大鼠胫骨最大应力、断裂力降低(P<0.05)。
5各组大鼠胫骨骨形成相关蛋白的变化情况
5.1各组大鼠胫骨ALP蛋白表达情况
与空白对照组比，尾吊组大鼠胫骨中ALP蛋白表达量显著降低(P＜0.01)。与尾吊组比，健脾组和补肾组大鼠胫骨中ALP蛋白表达量升高(P＜0.05)，补肾健脾组大鼠胫骨中ALP蛋白表达量显著升高(P＜0.01)；与补肾健脾组比，健脾组和补肾组大鼠胫骨中ALP蛋白表达量降低(P＜0.05)。
5.2各组大鼠胫骨SPARC蛋白表达情况
与空白对照组比，尾吊组大鼠胫骨SPARC蛋白表达量显著降低(P＜0.01)。与尾吊组比，健脾组和补肾组大鼠胫骨SPARC蛋白表达量升高(P＜0.05)，补肾健脾组大鼠胫骨SPARC蛋白表达量显著升高(P＜0.01)；与补肾健脾组比，健脾组和补肾组大鼠胫骨SPARC蛋白表达量降低(P＜0.05)。
5.3各组大鼠胫骨ATF4蛋白表达情况
与空白对照组比，尾吊组大鼠胫骨中ATF4蛋白表达量显著降低(P＜0.01)。与尾吊组比，健脾组和补肾组大鼠胫骨中ATF4蛋白表达量升高(P＜0.05)，补肾健脾组大鼠胫骨中ATF4蛋白表达量显著升高(P＜0.01)；与补肾健脾组比，健脾组和补肾组大鼠胫骨中ATF4蛋白表达量降低(P＜0.05)。
6各组大鼠胫骨经典Wnt信号通路相关蛋白的变化情况
6.1各组大鼠胫骨β-catenin蛋白表达情况
与空白对照组比，尾吊组大鼠胫骨β-catenin蛋白表达量显著降低(P＜0.01)；与尾吊组比，健脾组和补肾健脾组大鼠胫骨β-catenin蛋白表达量显著升高(P＜0.01)；与补肾健脾组比，补肾组大鼠胫骨β-catenin蛋白表达量降低(P＜0.05)。
6.2各组大鼠胫骨DKK1蛋白表达情况
与空白对照组比，尾吊组大鼠胫骨DKK1蛋白表达量显著升高(P＜0.01)；与尾吊组比，补肾组和补肾健脾组大鼠胫骨DKK1蛋白表达量显著降低(P＜0.01)；与补肾健脾组比，健脾组大鼠胫骨DKK1蛋白表达量升高(P＜0.05)。
6.3各组大鼠胫骨Kremen2蛋白表达情况
与空白对照组比，尾吊组大鼠胫骨Kremen2蛋白表达量显著升高(P＜0.01)；与尾吊组比，健脾组、补肾组和补肾健脾组大鼠胫骨Kremen2蛋白表达量降低(P＜0.05)；与补肾健脾组比，补肾组大鼠胫骨Kremen2蛋白表达量升高(P＜0.05)。
6.4各组大鼠胫骨SFRP2蛋白表达情况
与空白对照组比，尾吊组大鼠胫骨SFRP2蛋白表达量显著降低(P＜0.01)；与尾吊组比，补肾组和补肾健脾组大鼠胫骨SFRP2蛋白表达量显著升高(P＜0.01)；与补肾健脾组比，健脾组大鼠胫骨SFRP2蛋白表达量降低(P＜0.05)。
结论：
1基于“脾肾相关”理论，结合骨质疏松症的中医病因病机理论，采用补肾健脾方、补肾方和健脾方干预尾部悬吊大鼠骨丢失模型，发现三种治法均能够增加尾吊大鼠股骨和胫骨BMD、骨量，改善骨小梁微结构，对尾吊大鼠骨丢失具有改善作用，从而防治废用性骨质疏松症，以补肾健脾方为优。
2补肾健脾方、补肾方和健脾方均能够改善尾吊大鼠生物力学性能，降低骨质疏松性骨折发生的风险，以补肾健脾方为优。
3补肾健脾方、补肾方和健脾方干预尾吊大鼠骨形成的机制：通过增加骨形成早期蛋白ALP表达，相应的转录因子ATF4的表达，以及激活下游通路的SPARC、SFRP2蛋白的表达，减少通路拮抗剂DKK1和Kremen2的表达，激活经典Wnt信号通路，促进核心蛋白β-catenin入核表达，进一步促进下游转录调控骨形成，从而对抗尾吊导致的骨丢失。