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纳米氧化钛(TiO2)作为一种多功能材料，由于其独特的理化性质，包括小尺寸、大比表面积、低熔点、强稳定性、磁性、紫外线吸收能力等，已广泛应用于涂料、化妆品、食品工业、植入式医疗器械、药物制剂自清洁、光催化剂、光伏电池和传感器等多个领域。由于纳米TiO2的广泛应用，人体经常接触到纳米TiO2。纳米TiO2可以通过皮肤、消化道、肺吸入、医学植入等途径进入人体，并在各个器官内累积，对各个器官如肺、肝脏、脾脏、肾、大脑、睾丸产生影响。最近，关于纳米TiO2的生殖毒性也引起了人们的高度关注。
诸多研究表明，纳米TiO2可以透过血睾屏障，进入睾丸并造成睾丸损伤、精子畸形、精子数量减少和生殖能力下降，但目前尚无数据显示这些损伤是否与睾丸间质细胞睾酮分泌下降有关，关于纳米TiO2作用的分子机制研究也未有文献报道。众所周知，睾丸间质细胞能合成雄性激素，雄性激素可促进精子的发生和睾丸的发育。鉴于此，本论文以大鼠睾丸间质细胞为实验模型，将原代培养的大鼠睾丸间质细胞暴露于不同浓度的纳米TiO2，研究纳米TiO2对原代培养大鼠睾丸间质细胞产生的形态和结构损伤、睾酮分泌的影响及其作用的分子机制。本学位论文不仅可以为纳米生物学安全性评价提供理论支持，也可以为纳米TiO2诱导的雄性生殖毒性提供预防措施和治疗靶点。
本学位论文主要涉及以下两方面内容:
(1)将原代培养的大鼠睾丸间质细胞暴露于不同浓度的纳米TiO2(10、20和40μg/mL)24h，研究细胞活性、超微结构、纳米TiO2在细胞内的分布、线粒体膜电位(MMP)、细胞上清中睾酮水平和睾酮合成相关蛋白表达。研究结果表明，随着纳米TiO2浓度的增加，大鼠睾丸间质细胞活性呈剂量依赖性下降。透射电镜观察发现，纳米TiO2进入细胞，在细胞内积累，并对细胞产生不同程度的损伤。激光共聚焦显微镜观察到纳米TiO2不仅能进入细胞质，也可进入细胞核。线粒体膜电位分析表明纳米TiO2处理后间质细胞的MMP分别下降了36.13％、45.26％和79.63％，说明纳米TiO2破坏了细胞线粒体的功能。对细胞上清中睾酮含量分析表明，纳米TiO2浓度在20μg/mL和40μg/mL时，睾酮水平与对照组相比分别下降了11.40％和44.93％，10μg/mL纳米TiO2处理组睾酮水平与对照组相比差异不明显。可见中、高浓度纳米TiO2对睾酮合成有明显的抑制作用。对睾酮合成相关蛋白表达分析，结果显示，与对照组相比，StAR分别下降了14.7％、44.11％和72.05％;3β-HSD分别下降了26.56％、50％和79.69％;P450scc分别下降了39.41％、55.26％和86.84％，说明纳米TiO2对睾酮合成抑制作用是通过下调睾酮生成过程中相关酶的表达实现的。为进一步研究其分子机制，本研究还分析了上述蛋白的上游信号分子蛋白表达，结果表明p-ERK1/2、PKA、PKC、SR-BI表达均下降，与对照组相比，分别下降了27.83％、63.61％和78.89％;47.26％、70.54％和85.61％;30％、50％和71％;16.41％、41.79％和67.16％，而抑制因子DAX-1表达上调，分别是对照组的1.31倍、1.63倍和3.18倍。这些结果表明，纳米TiO2对睾酮合成抑制作用与ERK1/2-PKA-PKC信号通路功能紊乱有关。
(2)为了研究纳米TiO2抑制睾酮合成过中对cAMP的调控作用，本文利用苏木精-伊红染色法观察了原代培养睾丸间质细胞的细胞形态，利用流式细胞仪分析了细胞凋亡率，利用试剂盒检测了活性氧自由基(ROS)、活性氮自由基(RNS)、超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮(NO)、环磷酸腺苷(cAMP)和环磷酸鸟苷(cGMP）水平，利用Western blot方法分析了激素受体HCGR和LHR的蛋白表达水平。结果表明，纳米TiO2染毒后睾丸间质细胞皱缩变形，在纳米TiO2浓度为20μg/mL和40μg/mL时，细胞早期凋亡率分别增加了4.34倍和4.94倍;NO分别增加了1.1和2.86倍，10μg/mL纳米TiO2处理组这两个指标与对照组相比差异未达显著水平。在纳米TiO2浓度为10μg/mL、20μg/mL和40μg/mL时，ROS分别增加了0.71、3.15和3.43倍;RNS分别增加了0.62、1.34和1.14倍;SOD活性分别下降了18.3％、28.16％和67.6％;这些结果表明纳米TiO2处理引起的睾丸间质细胞损伤与细胞的氧化和抗氧化失衡有关。纳米TiO2经过处理后，cAMP含量分别下降了48％、48％和47.6％;cGMP含量分别下降了18.7％、52.2％和56.7％;HCGR蛋白表达分别下降了26.7％、45.07％和74.64％;LHR蛋白表达分别下降了18.3％、28.16％和67.6％。结论表明纳米TiO2对睾丸间质细胞睾酮合成的抑制与cAMP/cGMP信号通路功能紊乱有关。
诸多研究表明，纳米TiO2可以透过血睾屏障，进入睾丸并造成睾丸损伤、精子畸形、精子数量减少和生殖能力下降，但目前尚无数据显示这些损伤是否与睾丸间质细胞睾酮分泌下降有关，关于纳米TiO2作用的分子机制研究也未有文献报道。众所周知，睾丸间质细胞能合成雄性激素，雄性激素可促进精子的发生和睾丸的发育。鉴于此，本论文以大鼠睾丸间质细胞为实验模型，将原代培养的大鼠睾丸间质细胞暴露于不同浓度的纳米TiO2，研究纳米TiO2对原代培养大鼠睾丸间质细胞产生的形态和结构损伤、睾酮分泌的影响及其作用的分子机制。本学位论文不仅可以为纳米生物学安全性评价提供理论支持，也可以为纳米TiO2诱导的雄性生殖毒性提供预防措施和治疗靶点。
本学位论文主要涉及以下两方面内容:
(1)将原代培养的大鼠睾丸间质细胞暴露于不同浓度的纳米TiO2(10、20和40μg/mL)24h，研究细胞活性、超微结构、纳米TiO2在细胞内的分布、线粒体膜电位(MMP)、细胞上清中睾酮水平和睾酮合成相关蛋白表达。研究结果表明，随着纳米TiO2浓度的增加，大鼠睾丸间质细胞活性呈剂量依赖性下降。透射电镜观察发现，纳米TiO2进入细胞，在细胞内积累，并对细胞产生不同程度的损伤。激光共聚焦显微镜观察到纳米TiO2不仅能进入细胞质，也可进入细胞核。线粒体膜电位分析表明纳米TiO2处理后间质细胞的MMP分别下降了36.13％、45.26％和79.63％，说明纳米TiO2破坏了细胞线粒体的功能。对细胞上清中睾酮含量分析表明，纳米TiO2浓度在20μg/mL和40μg/mL时，睾酮水平与对照组相比分别下降了11.40％和44.93％，10μg/mL纳米TiO2处理组睾酮水平与对照组相比差异不明显。可见中、高浓度纳米TiO2对睾酮合成有明显的抑制作用。对睾酮合成相关蛋白表达分析，结果显示，与对照组相比，StAR分别下降了14.7％、44.11％和72.05％;3β-HSD分别下降了26.56％、50％和79.69％;P450scc分别下降了39.41％、55.26％和86.84％，说明纳米TiO2对睾酮合成抑制作用是通过下调睾酮生成过程中相关酶的表达实现的。为进一步研究其分子机制，本研究还分析了上述蛋白的上游信号分子蛋白表达，结果表明p-ERK1/2、PKA、PKC、SR-BI表达均下降，与对照组相比，分别下降了27.83％、63.61％和78.89％;47.26％、70.54％和85.61％;30％、50％和71％;16.41％、41.79％和67.16％，而抑制因子DAX-1表达上调，分别是对照组的1.31倍、1.63倍和3.18倍。这些结果表明，纳米TiO2对睾酮合成抑制作用与ERK1/2-PKA-PKC信号通路功能紊乱有关。
(2)为了研究纳米TiO2抑制睾酮合成过中对cAMP的调控作用，本文利用苏木精-伊红染色法观察了原代培养睾丸间质细胞的细胞形态，利用流式细胞仪分析了细胞凋亡率，利用试剂盒检测了活性氧自由基(ROS)、活性氮自由基(RNS)、超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮(NO)、环磷酸腺苷(cAMP)和环磷酸鸟苷(cGMP）水平，利用Western blot方法分析了激素受体HCGR和LHR的蛋白表达水平。结果表明，纳米TiO2染毒后睾丸间质细胞皱缩变形，在纳米TiO2浓度为20μg/mL和40μg/mL时，细胞早期凋亡率分别增加了4.34倍和4.94倍;NO分别增加了1.1和2.86倍，10μg/mL纳米TiO2处理组这两个指标与对照组相比差异未达显著水平。在纳米TiO2浓度为10μg/mL、20μg/mL和40μg/mL时，ROS分别增加了0.71、3.15和3.43倍;RNS分别增加了0.62、1.34和1.14倍;SOD活性分别下降了18.3％、28.16％和67.6％;这些结果表明纳米TiO2处理引起的睾丸间质细胞损伤与细胞的氧化和抗氧化失衡有关。纳米TiO2经过处理后，cAMP含量分别下降了48％、48％和47.6％;cGMP含量分别下降了18.7％、52.2％和56.7％;HCGR蛋白表达分别下降了26.7％、45.07％和74.64％;LHR蛋白表达分别下降了18.3％、28.16％和67.6％。结论表明纳米TiO2对睾丸间质细胞睾酮合成的抑制与cAMP/cGMP信号通路功能紊乱有关。