Cullin4B(CUL4B)属于Cullin家族，该家族成员是目前已知的最大的一类E3泛素连接酶复合物(Cullin-RING E3 ligase，CRLs)的骨架蛋白，通过泛素化修饰底物蛋白而发挥生物学功能。目前发现，CUL4B在胚胎发育、神经发育、DNA损伤修复、细胞周期、细胞分化以及肿瘤的发生和发展等多种生命活动中具有重要的调控功能。CUL4B丧失功能突变导致个体发育异常，而CUL4B在食管癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、结肠癌、胃癌以及卵巢癌等实体瘤中高表达、发挥癌基因作用。
　　髓源抑制细胞(Myeloid-derived suppressor cell，MDSCs)来源于骨髓造血干细胞，是一类未成熟的髓系细胞，在炎症、自身免疫疾病和肿瘤等多种病理条件下发生累积和活化，影响机体免疫能力。实验室的前期研究结果显示，造血系统敲除Cul4b导致小鼠CD11b+Gr1+细胞群累积和活化。移植瘤模型分析显示，宿主造血系统缺失Cul4b促进移植瘤生长和转移，并促进MDSCs的累积和活化。提示Cul4b在肿瘤微环境中发挥抑癌基因的作用。为探究髓系细胞缺失Cul4b是否也能促进移植瘤的生长和转移以及Cul4b缺失型MDSCs促进肿瘤生长和转移的分子机制，本课题进行了如下探究。
　　第一部分CUL4B缺失增强髓源抑制细胞促瘤潜力
　　为了探究髓系细胞缺失Cul4b能否促进移植瘤的生长，我们利用Cre-loxp系统建立了髓系细胞特异性敲除Cul4b基因条件性敲除小鼠(MKO)，并进行了以下分析:
　　1.构建髓系细胞特异性敲除Cul4b基因小鼠模型
　　为获得髓系细胞特异性敲除Cul4b基因小鼠，将实验室前期构建的Cul4bflox/flox基因打靶小鼠与LysM-Cre+/-转基因鼠交配，获得了Cul4bflox/YysM-Cre+/-条件性敲除小鼠(MKO)。利用Western-Blot和实时定量PCR技术证实Cul4b在MKO小鼠MDSCs中得到有效敲除。流式细胞术检测发现，MKO小鼠血液中CD11b+Gr1+细胞比例明显高于野生型小鼠，并且MKO小鼠脾脏略大于野生型小鼠。
　　2.宿主髓系细胞缺失Cul4b促进移植瘤生长并伴随MDSCs累积
　　B16/F0细胞荷瘤实验发现，MKO小鼠皮下肿瘤生长能力明显高于野生型小鼠，并伴随血液、骨髓和脾脏中MDSCs异常累积，这与阳性对照Cul4bflox/YTek-Cre+/-小鼠(TKO)移植瘤生长能力及MDSCs累积相一致。BALB/c来源的4T1细胞荷瘤实验发现，MKO小鼠排斥异源细胞的能力显著低于野生型小鼠。
　　3.CUL4B缺失导致MDSCs促瘤潜力增强
　　为了明确MKO小鼠增加的促瘤能力是MDSC介导的，我们将肿瘤细胞与从WT和MKO荷瘤小鼠分离得到的MDSCs分别共注射到野生型C57BL/6小鼠，结果发现Cul4b缺失型MDSCs具有更强的促瘤能力和促转移能力;对MDSCs的组成分析未检测到两种基因型小鼠M-MDSCs和G-MDSCs的组成上存在明显差异。
　　以上结果显示，髓系细胞特异性敲除Cul4b促进移植瘤生长，而且这种作用是通过增加MDSCs活性介导的。
　　第二部分CUL4B调控MDSCs的非T细胞依赖性促瘤潜力
　　MDSCs促进肿瘤生长和转移的途径根据是否依赖于T细胞分为T细胞依赖性和非T细胞依赖性促瘤途径。为明确CUL4B在调控MDSCs非T细胞依赖性促瘤途径中的作用，我们进行了以下分析:
　　1.利用裸鼠荷瘤实验分析CUL4B缺失对MDSCs促瘤能力的影响
　　将肿瘤细胞与MDSCs以1∶3混合注射到无胸腺裸鼠皮下，结果发现MKO-MDSCs具有更强的促瘤能力。
　　2.利用共培养体系分析CUL4B缺失对MDSCs促瘤能力的影响
　　MKO-MDSCs与肿瘤细胞共培养，对共培养后4T1细胞进行平板克隆分析，结果发现与MKO-MDSCs共培养的4T1细胞表现出更强的增殖能力;细胞凋亡检测发现与MKO-MDSCs共培养的B16/F0细胞凋亡减少;流式细胞术检测分析发现与MKO-MDSCs共培养的B16/F0细胞中CD133+细胞、4T1细胞中CD44+CD24low细胞群明显增加，显示干细胞比例增加;成球实验也表明与MKO-MDSCs共培养的4T1细胞具有更强的成球能力;实时定量PCR结果显示与MKO-MDSCs共培养的肿瘤细胞中Sox2，Nanog和Oct4等干性基因的表达明显高于与WT-MDSCs共培养的细胞。体内实验也发现，与MKO-MDSCs共培养的B16/F0细胞具有更强的成瘤能力。
　　3.利用条件培养基分析CUL4B缺失对MDSCs促瘤能力的影响
　　为了探究CUL4B缺失增强MDSCs促瘤能力的机制，我们利用MDSCs条件培养基和MEFs条件培养基处理4T1细胞。结果发现MKO-MDSCs条件培养基具有更强的促进肿瘤细胞的增殖作用;干性表面标志物流式细胞术检测发现经MKO-MDSCs条件培养基处理的B16/F0细胞CD133+细胞、4T1细胞中CD44+CD24low细胞群明显增加;成球实验也表明经MKO-MDSCs条件培养基处理的4T1细胞具有更强的成球能力。实时定量PCR结果显示经MKO-MDSCs条件培养基处理的肿瘤细胞中Sox2，Nanog和Oct4等干性基因的表达明显高于经WT-MDSCs条件培养基处理的细胞。体内实验发现，经MKO-MDSCs条件培养基处理的B16/F0细胞具有更强的成瘤能力和转移能力。
　　以上结果显示，髓系细胞缺失CUL4B可能是通过改变MDSCs分泌因子而发挥更强的促瘤作用。
　　第三部分CUL4B通过调控IL-6/p-STAT3通路促进肿瘤细胞干性
　　为寻找CUL4B调控的MDSCs分泌因子及其调控机制，本部分进行了以下分析:
　　1.CUL4B缺失型MDSCs分泌更多的IL-6
　　为了探究MKO-MDSCs条件培养基促进肿瘤细胞增殖和干性的分泌因子，我们利用3kD分子筛以及加热处理分析不同组分条件培养基的作用，结果发现，促进肿瘤细胞增殖的物质存在于大于3kD的MKO-MDSCs条件培养基组分中，并且这种物质具有热不稳定性;通过ELISA实验检测MDSCs条件培养基以及小鼠血清中细胞因子的表达情况，结果发现，IL-6在MKO-MDSCs条件培养基中高表达，并且在肿瘤形成早期MKO小鼠血清中的IL-6含量也明显高于WT小鼠。为进一步证实MKO-MDSCs条件培养基增高的促瘤作用是通过增加的IL-6分泌介导的，我们利用anti-IL-6中和抗体进行了封闭实验，结果发现anti-IL-6中和抗体能够有效降低MKO-MDSCs条件培养基促进肿瘤细胞增殖和干性的作用。
　　2.IL-6激活肿瘤细胞STAT3信号通路
　　IL-6作为细胞因子发挥生物学功能，需要通过细胞膜受体影响肿瘤细胞中关键信号通路的变化，因此我们检测了IL-6下游JAK/STAT3信号通路的变化。结果发现，来自于MKO-MDSCs共注射的肿瘤以及来自于MKO小鼠移植瘤中的p-STAT3(Y705)水平明显高于相应的WT组，并且MKO-MDSCs条件培养基具有更强的激活肿瘤细胞p-JAK2(S1007/1008)和p-STAT3(Y705)能力。为了探究MKO-MDSCs促进肿瘤细胞的增殖和干性是通过激活肿瘤细胞STAT3引起的，我们利用p-STAT3抑制剂(Stattic)和干扰4T1细胞STAT3表达进行了拯救实验，结果显示，无论是抑制剂Stattic处理还是干扰STAT3表达均能有效降低MKO-MDSCs条件培养基促进肿瘤细胞增殖和干性的作用。
　　3.CRL4B/HDAC/PRC2复合物抑制IL-6基因转录
　　为分析CUL4B缺失增加MDSCs分泌IL-6的机制，我们首先通过实时定量PCR、Western-blot实验以及ELISA实验从RNA和蛋白质水平检测了CUL4B缺失对IL-6表达的影响，发现MKO-MDSCs和CUL4B敲低RAW264.7细胞中IL-6的mRNA和蛋白水平均明显上调，并且发现在小鼠荷瘤模型和肿瘤患者外周血MDSCs中IL-6转录水平与CUL4B呈负相关，提示CUL4B抑制Il-6转录。为了探究CUL4B抑制Il-6转录的机制，我们利用ChIP实验发现CUL4B、H2AK119ub1、EZH2、DNMT3A、HDAC1和HDAC3在Il-6转录起始位点上游1023～1140区域均有结合，qChIP实验显示CUL4B通过招募PRC2和HDAC复合物调控Il-6的转录。利用HDAC抑制剂(TSA)和PRC2复合物抑制剂(Dzep)处理CUL4B高表达的Raw264.7细胞，结果发现TSA和Dzep均能拯救CUL4B过表达对IL-6的抑制作用。
　　综上所述，本课题研究得出如下结论:
　　1.髓系细胞特异性敲除Cul4b基因导致小鼠MDSCs累积及活性增强;
　　2.CUL4B缺失增强MDSCs的非T细胞依赖性促瘤潜力;
　　3.CUL4B缺失导致MDSCs分泌更多的IL-6，进而通过激活肿瘤细胞中STAT3信号通路促进肿瘤细胞增殖和干性;
　　4.CRL4B复合物协同HDAC和PRC2复合物抑制Il-6的转录。