忍冬（Lonicera japonica Thunb.）为忍冬科（Caprifoliaceae）忍冬属(Lonicera)植物，其干燥花蕾或带初开的花称之为金银花，是中国常用的著名中药材之一。2005年版《中国药典》将忍冬规定为中药材金银花的唯一植物来源。然而，我国历史及传统上作为中药金银花流通及使用的忍冬属植物却不限于忍冬这一个种，灰毡毛忍冬(L.macranthoides Hand.-Mazz.)在中医药临床应用与中药制剂中曾一直作为金银花使用。　　尽管灰毡毛忍冬也被《中国药典》收录，但其被归入山银花，而各种中药配方一直沿用金银花，导致我国南方数省出产的灰毡毛忍冬很快就失去了中药材市场。灰毡毛忍冬能否继续作为中药材金银花来使用？主要争论在于忍冬主要药效成分之一的木犀草苷在灰毡毛忍冬花蕾中含量较低，达不到同等药效。因此，研究忍冬和灰毡毛忍冬中的木犀草苷合成机制，对灰毡毛忍冬的品质改良具有深远意义。　　本研究分别从忍冬和灰毡毛忍冬中克隆得到了木犀草苷合成途径中的关键基因—黄酮合酶基因(FNS)。忍冬中克隆得到两个FN基因（LjFNSⅡ-1和LjFNSⅡ-2），它们均通过不同的剪接方式得到两个转录本（LjFNSⅡ-1.1和LjFNSⅡ-1.2;LjFNSⅡ-2.1和LiFNSⅡ-2.2），较长的转录本（LjFNⅡ-1.1和LjFNSⅡ-2.1）的氨基酸序列之间仅有一个氨基酸差异（242位的赖氨酸突变成谷氨酸）。灰毡毛忍冬中克隆也得到两个FNS基因，其中一个（LmFNSⅡ-1）有一个长的转录本（LmFNSⅡ-1.1）和一个短的转录本（LmFNSⅡ-1.2），其剪接模式与LjFNSⅡ-1一致，且LmFNSⅡ-1.1和LjFNSⅡ-1.1的氨基酸序列之间有十个氨基酸差异位点。LmFNSⅡ-2只有一个短的转录本，氨基酸序列与LjFNSⅡ-2.2一致。根据氨基酸比对、保守区域分析以及系统进化树分析，推测克隆所得的FNSs均属于细胞色素P450蛋白家族的CYP93B成员，属于直接催化黄烷酮生成黄酮的FNSⅡ酶类。　　亚细胞定位分析发现，从忍冬和灰毡毛忍冬中克隆得到的黄酮合酶基因编码的蛋白均定位在内质网上。将FNSⅡs在酵母中进行异源表达，体内酶活实验表明，较长的转录本所编码的蛋白（LjFN SⅡ-1.1、LjFNSⅡ-2.1和LmFNSⅡ-1.1）具有催化活性，可以将黄烷酮底物直接催化生成黄酮昔元，而短的转录本不具备催化活性。提取表达异源FNSⅡs的酵母的微粒体，并进行体外酶活鉴定和酶动力学分析，发现LjFNSⅡ-1.1催化圣草酚生成木犀草素的效率最高，LjFNSⅡ-2.1次之，LmFNSⅡ-1.1的转化效率最低。　　分别对LjFN SⅡ-1.1和LjFNSⅡ-2.1进行同源建模并将二者的结构比对分析，发现LjFNSⅡ-1.1中242位的碱性氨基酸会破坏蛋白中其所在的α-helix的稳定性，从而使其具有较高的催化活性。为进一步分析造成LjFN SⅡ-1.1和LmFNSⅡ-1.1酶活性差异的原因，将两者的氨基酸差异位点进行定点突变分析，发现位于LjFNSⅡ-1.1中206位的甲硫氨酸和381位的亮氨酸对其催化活性起促进作用;而122位的丝氨酸则抑制了其活性。LmFNSⅡ-1.1中120位（对应于上述122位）的丙氨酸则对其催化活性十分重要，将其突变成丝氨酸时，几乎检测不到木犀革素的生成。同时，将建模所得的蛋白模型与底物圣草酚进行分子对接，分析了其中一些位点引起酶催化活性差异的原因。　　为研究Lj FNSⅡ-1.1、Lj FNSⅡ-2.1和LmFNSⅡ-1.1基因在植物体内的功能，通过农杆菌介导叶盘法将其分别转入烟草。与对照相比，35S∷LjFNSⅡ-1.1植株中合成了木犀草素-7-O-葡萄糖苷以及芹菜素-7-O-葡萄糖苷等黄酮类化合物。荧光定量PCR结果表明忍冬和灰毡毛忍冬的花蕾中FNSⅡ的表达模式与黄酮类化合物的积累趋势一致。组织特异性表达分析及Lm FNSⅡ-1.1启动子驱动GUS表达分析表明，灰毡毛忍冬中的Lm FNSⅡ-1.1主要在叶片中表达，在花中的表达量很低。以上结果表明，灰毡毛忍冬的Lm FNSⅡ-1.1基因在花蕾中表达量低，且LmFN SⅡ-1.1的催化活性较低，二者是导致其花蕾中木犀革苷含量低的原因。　　忍冬花量少，开花时间不集中;而以灰毡毛忍冬为种源形成的一系列品种，其花蕾数量多、花冠整齐、花期集中，产量显著高于忍冬来源的品种，在生产上可节约采摘时间和劳动成本。今后，通过分子育种手段定向提高灰毡毛忍冬花中木犀草苷的含量，将有望作为忍冬（金银花）的优良替代品。本研究揭示了灰毡毛忍冬中木犀草苷含量低的成因，对灰毡毛忍冬及其品种的品质改良和培育新品种具有重要意义。