蛋白质组酶解的新技术和新方法研究

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在基于鸟枪法的蛋白质组学研究中,蛋白质酶解是必不可少的步骤。本论文为提高蛋白质样品的酶解速度,以及消除对质谱鉴定的干扰,发展了蛋白质组酶解的新技术和新方法,具有重要的科学意义和实用价值。   以有机-无机杂化硅胶材料作为基质,通过一步的环氧—戊二醛反应实现了胰蛋白酶的固定化,制备了一种基于有机-无机杂化硅胶整体材料的固定化酶反应器(Immobilizedenzymereactor,IMER)。可将牛血清白蛋白(BSA)的酶解时间从16h缩短到50s,取得与自由溶液酶解相当的序列覆盖率。将其应用于鼠肝提取蛋白质分析,经80s酶解,可从2μg大肠杆菌提取蛋白中鉴定出84种蛋白质。   通过热聚合的方式,制备了一种基于聚(丙烯酰胺-CO-双甲基丙烯酰胺)亲水性整体材料的IMER。不仅具有良好渗透性、机械强度和亲水性,而且能够在20s内完成BSA的酶解,序列覆盖率达到57%,优于传统的12h自由溶液酶解(42%)。酶解蛋白质的最小浓度可达到fmol。将其应用于大肠杆菌提取蛋白质分析,经20s的酶解,可从2μg大肠杆菌提取蛋白中鉴定出333种蛋白质。   以聚乙烯乙二胺为做为金属离子的固定化配体,研制了一种基于聚丙烯酰胺基质的金属离子鳌合再生型IMER。与传统的金属离子再生型IMER相比,可将再生步骤从2步缩短为1步。将其用于大肠杆菌提取蛋白的分析酶解,经50s的酶解,可从150ng样品中提取鉴定出78种蛋白质。   提出一种相比与传统尿素辅助的胰蛋白酶酶解更为高效的蛋白质样品处理方法。该方法特点在于将天冬氨酸位点的化学切割与胰蛋白酶切割相结合。使用这种方法分析鼠肝蛋白质组,鉴定出1335条肽段,对应295种蛋白质;而使用传统尿素辅助方法处理,只鉴定出1107条肽段,对应231种蛋白质。
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