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人载脂蛋白A Ⅰ(apolipoprotein A Ⅰ,ApoA Ⅰ)分子为243个氨基酸残基组成的单一肽链,分子质量为28.3 ku,主要在肝脏中合成,是高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)的重要组分,无糖基化修饰,具较强的疏水性[1,9].1992年上海医科大学药学院研究人员发现[2]ApoA Ⅰ能特异性地识别肝细胞表面受体.根据这一特性,可以将人血浆中提取的天然ApoA Ⅰ与卵磷脂、抗肿瘤药物等重组成复合物,通过ApoA Ⅰ将药物靶向运入肝癌细胞,对肝癌细胞有杀伤作用,这一研究已取得初步的成果.用基因工程方法制备ApoA Ⅰ,可克服从人血浆中制备ApoA Ⅰ产量低、步骤多、成本高的缺点,有利于靶向药物的大规模生产.在之前的实验中我们在毕赤氏酵母中分泌表达了rApoA Ⅰ,但与标准蛋白相比,其N-末端不均一且C-末端缺失了部分氨基酸.为了解决这两个问题,我们将除去上游EAEA编码序列的人工基因apoA Ⅰ和天然基因apoA Ⅰ分别插入分泌型载体pPIC9K,将重组的pPIC9K-apoA Ⅰ和pPIC9K-apoA Ⅰ用BglⅡ酶切后,转化Pichiapastoris GS115和SMDll68菌株,筛选获得G418高抗性转化子.转化子经摇瓶发酵和甲醇诱导,上清液用SDS-PAGE与Western blotting检测,有明显的rApoA Ⅰ表达,说明去除部分信号肽酶识别序列后,并不影响rApoA Ⅰ的分泌表达,但仍未能解决C-末端降解的问题.所以我们决定尝试胞内表达rApoA Ⅰ的路线:将PCR扩增得到的apoA Ⅰ基因片段插入胞内表达质粒pPIC3.5K,重组的pPIC3.5K-apoAⅠ用BglⅡ酶切后,转化Pichiapastoris GS115菌株,筛选获得G418高抗性转化子,再通过PCR鉴定证实apoA Ⅰ基因已整合到染色体上.其转化子经摇瓶发酵和甲醇诱导,收集细胞裂解后,用SDS-PAGE与Western blotting检测,证明胞内有明显的rApoA Ⅰ表达,其分子质量与人血浆提取的ApoA Ⅰ相同.我们用毕赤氏酵母表达系统成功地表达人apoA Ⅰ cDNA,为今后运用基因工程大量生产rApoA Ⅰ奠定了基础,为进一步研制新型抗肝癌的靶向药物和临床应用创造了条件.