颗粒裂解肽(Granulysin)是细胞毒性淋巴细胞CTL和天然杀伤细胞NK内的颗粒中含有的一种多肽,天然颗粒裂解肽和重组颗粒裂解肽都具有广谱抗菌活性。对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、寄生虫等均具有杀伤活性,尤其是对分枝杆菌有直接的细胞毒性。　　G13结构域具有抑制细菌、真菌生长繁殖的活性,但对动物细胞和脂质体没有影响。目前药物多肽主要通过化学方法合成和基因工程方法生产。由于化学方法合成多肽成本较高,所以本研究使 G13结构域在大肠杆菌中表达,得到有活性的重组颗粒裂解肽G13结构域,从而为G13杀菌机理的研究和开发经济有效的生产方法奠定基础。　　本研究根据已报道的G13结构域氨基酸序列以及大肠杆菌密码子的偏好性化学合成了G13结构域对应的编码区的有意义链。以合成的序列为模板、用相应的特异性引物PCR扩增 G13结构域编码区。将 PCR产物直接克隆到pBAD/TOPO ThioFusion表达载体上,经过菌液PCR初步鉴定,筛选出阳性重组子,序列分析表明目的基因已克隆到T载体中。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,并在基因工程菌株培养过程中加入诱导剂阿拉伯糖,在诱导时间为0h、2h、4h和5h条件下收集适量菌液,检测目的蛋白的表达。SDS-PAGE分析表明在约15kD处出现一特异性条带,而对照菌没有出现这条带,但蛋白表达量很低。同时监测了基因工程菌株在加入诱导剂前后OD600值的变化,发现随着外源蛋白的表达,菌液OD600值下降,但随后又缓慢上升,将上升后的菌液提取质粒后重新转化大肠杆菌,挑取单克隆,测序发现,在培养的菌液中由于毒性蛋白表达带来的选择压力,启动子发生了下降突变。　　将引物的两端加入Eco R I、Sal I限制性内切酶位点后,回收纯化后的G13结构域PCR产物,用Eco R I、Sal I限制性内切酶进行酶切后连接到原核表达载体pThioHisA的相应酶切位点上。将重组过的表达载体转化大肠杆菌BL21感受态细胞,加入 IPTG诱导目的蛋白的表达,表达产物经 SDS-PAGE分析,在约1.6kD的位置有目的条带,而对照菌无此特异性条带,经凝胶分析软件BandScan灰度扫描分析目的蛋白占总蛋白的55％。目的蛋白以包涵体形式存在,用尿素溶解包涵体,融合蛋白得到初步的纯化,为后续的活性实验奠定了基础。