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上世纪八十年代，光动力学治疗(photodynamic therapy，PDT)方法的出现逐渐成为人们关注的焦点，作为一种新兴的癌症治疗手段，它包含三个关键因素，即激发光、氧气和光敏剂(photosensitizer，PS)。富集在肿瘤部位的光敏剂经过特定光源照射后，可与细胞内的氧气发生反应产生大量单态氧等活性氧物种(reactive oxygen species，ROS)从而诱导肿瘤细胞凋亡。与传统的癌症治疗方法相比，它具有可控的局部毒性、无创性、副作用小、成本较低等特点，且能够较好地保持组织器官的完整性，已广泛应用于临床。但由于目前美国食品药品监督管理局(food and drug administration，FDA)认证的光敏剂大多是被紫外—蓝色范围的光激发的，它们在生物组织中的穿透深度十分有限(﹤0.5cm)，因此光动力学治疗仅被用于治疗体表或通过光纤可达到的病变部位，如皮肤癌、胃肠道肿瘤、呼吸道肿瘤和泌尿生殖系统肿瘤等，而对于深部或过厚、过大肿瘤的光动力学治疗，仍然是当前所面临的一大挑战。
由于X射线具有较好的组织穿透性，利用其间接激发纳米粒(nanoparticles，NPs)上搭载的光敏剂产生大量活性氧物种，从而诱导肿瘤细胞凋亡，这种新的光动力学治疗模式被称为“X射线激发光动力学治疗(X-ray excitedphotodynamic therapy， X-PDT)”。近年来，随着基于X射线激发发光纳米材料的发展为X-PDT带来了新纪元，X射线激发发光纳米粒—光敏剂耦合系统可提高活性氧物种的产生率，从而有效提升了肿瘤的治疗效果。目前，用于X-PDT的纳米材料主要有基于稀土金属闪烁发光纳米粒和基于金属硫/氧化物(金属)半导体发光纳米粒，由于应用于X-PDT的发光纳米粒仍存在着材料尺寸过大、粒径分布不均、形状不规则、性质不稳定等问题，导致出现纳米药物肿瘤富集率不高、极易受外界生物环境影响而分解、能量从X射线传递到光敏剂的效率较低以及X射线照射剂量过高等现象。所以，为了能够使低剂量X-PDT真正应用于临床治疗，必须解决以下三个关键问题：①如何制备出粒径尺寸适宜的(≦100nm)X射线激发发光纳米粒(X-ray excited luminescence nanoparticles，XLNPs)，使其能通过高通透性和滞留(enhancedpermeability and retentio，EPR)效应有效地富集在肿瘤部位？②如何制备出发光强度更高的X射线激发发光纳米粒？③如何设计并制备出荧光能量共振转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)效率高且生物安全性好的发光纳米粒—光敏剂耦合系统，从而有效降低X-PDT过程中X射线的照射剂量？
针对上述问题，本论文的主要研究内容有以下四个方面：
(1)X射线激发发光纳米材料的研究。针对目前X射线激发发光纳米粒存在的尺寸过大、粒径不均匀、形状不规则、发光弱等问题，我们采用“共沉淀”法成功制备出了三大类型的下转换发光纳米材料，包括β-NaGdF4:X%Tb3+纳米粒(X=3，5，7，12，15，18，22mol%)，NaLuF4:X%Tb3+纳米粒(X=3，6，9，12，15，18，21mol%)和NaLuF4:X%Gd3+15%Eu3+纳米粒(X=5，10，15，20，25，30mol%)，其具有良好的油溶特性。通过改变反应温度、反应时间、发光中心掺杂比例以及氟源与钠源的摩尔比例等反应参数，我们对每个制备过程中的反应机理、粒径与形貌控制以及发光强度进行了分析与讨论。综合利用TEM、HR-TEM、SEM、XRD、EDS和荧光分光光度计等仪器设备对制备出的纳米材料进行了形貌、晶格结构等表征分析及X射线激发发射光谱分析得出，β-NaGdF4:15%Tb3+纳米粒尺寸较小(9nm左右)，而β-NaLuF4:15%Tb3+纳米粒尺寸虽然稍大(28 nm)，但是其发光强度更高，约是前者的7倍，这两种类型发光纳米粒中掺杂的Tb3+离子特征发射峰与二代成熟光敏剂玫瑰红(rosebengal，RB)的吸收光谱高度匹配。此外，NaLuF4:X%Gd3+15%Eu3+纳米粒(X=5，10，15，20，25，30mol%)的发光强度较低，其中掺杂的Eu3+离子特征发射峰与玫瑰红的吸收光谱匹配程度较低。因此，我们从中优选出β-NaGdF4:15%Tb3+和β-NaLuF4:15%Tb3+纳米粒用于后续实验研究。
(2)X射线激发发光纳米粒—光敏剂耦合系统制备及其单态氧产生率的研究。由于通过“共沉淀”法初步制备的发光纳米粒表面被油酸基团包覆，无法在水溶液中进行分散，不能直接应用于生物医药领域。因此，首先通过配体交换的方式，将发光纳米粒表面的油酸基团置换为2—氨基乙基膦酸(2-aminoethylphosphonic acid， AEP)，以使其具备良好的水溶性和生物安全性，为后续与光敏剂的耦合做好准备，并通过测量傅里叶转换红外光谱(Fourier-transform infrared spectroscopy，FT-IR)确定了AEP的成功置换。然后，为了使发光纳米粒—光敏剂耦合系统具备高效FRET效率以生成较多的单态氧用于X-PDT，我们分别采用“静电吸附”和“共价耦合”的方式，将经过AEP修饰后的β-NaREF4:15%Tb3+(RE=Gd，Lu)纳米粒与玫瑰红进行联接，通过研究两种方式的机理得出，“共价耦合”方式制备出的发光纳米粒—玫瑰红耦合系统可耦合较多的玫瑰红，且FRET效率更高。再者，通过改变发光纳米粒与玫瑰红的配比制得不同的β-NaREF4:15%Tb3+NPs@AEP-RB(RE=Gd，Lu)耦合系统，测算其FRET效率得出，当纳米粒与玫瑰红的质量比值为20∶1和19.53125∶1时，两种耦合系统的FRET效率可达最大值，分别为99.63%和94.29%。最后，利用1，3—二苯基异苯并呋喃(1，3-diphenylisobenzofuran，DPBF)对不同浓度耦合系统的单态氧生成情况进行测算得出，在X射线照射下，两种耦合系统均可产生大量的单态氧，且其在溶液中的单态氧产生率随着耦合光敏剂的量的增加而增加。
(3)X射线激发发光纳米粒—光敏剂耦合系统的体外X-PDT评价研究。为了有效评价X射线激发发光纳米粒—光敏剂耦合系统的体外生物安全性、EPR效应引起的胞吞效率及体外X-PDT疗效，我们选取HepG2肝癌细胞对β-NaREF4:15%Tb3+(RE=Gd，Lu)纳米粒进行了胞吞实验，证明其可以顺利进至细胞内部，且随着时间增加，胞吞数量也随之增多。通过将不同浓度的β-NaREF4:15%Tb3+NPs@AEP-RB(RE=Gd，Lu)耦合系统与HepG2细胞共同孵育24h之后测得，两种类型耦合系统均具备较好的生物安全性。此外，将两种类型耦合系统分别与HepG2肝癌细胞共同孵育10h后，经X射线照射1.5h，检测得到细胞存活率分别为20%(β-NaGdF4:15%Tb3+NPs@AEP-RB)和10%(β-NaLuF4:15%Tb3+NPs@AEP-RB)。同时，使用2，7—二氯荧光黄双乙酸盐(2′，7′-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA)可检测到细胞内部均有单态氧存在，证实了肿瘤细胞的凋亡是由单态氧所引起的。这些为后续的裸鼠体内荷瘤实验奠定了基础。
(4)X射线激发发光纳米粒—光敏剂耦合系统的体内X-PDT评价研究。为了有效评价X射线激发发光纳米粒—光敏剂耦合系统的体内生物安全性及X-PDT疗效，我们依托在裸鼠大腿部位建立的HepG2肝癌细胞异位移植肿瘤模型，测算不同实验组的X射线照射剂量发现，β-NaGdF4:15%Tb3+NPs@AEP-RB耦合系统在低剂量(0.25Gy/次，照射4次，总计1Gy)X射线照射下，其平均抑瘤率为60%，而β-NaLuF4:15%Tb3+NPs@AEP-RB耦合系统在更低剂量(0.19Gy/次，照射1次，总计0.19Gy)X射线照射下，其抑瘤率可达到80%±12.3%。通过对比分析了不同分组的肿瘤重量、大小得出，实验组(耦合系统组)在不同X射线照射时间下均呈现出了较为理想的治疗效果。对上述两种类型耦合系统实验组瘤体的石蜡切片通过TUNEL染色发现，经X射线照射后，实验组(耦合系统组)的肿瘤细胞凋亡最为严重，且出现大面积坏死区域。同时，使用HE染色法观察各组裸鼠主要脏器发现，未经X射线照射的各组及单次照射20min组(0.19 Gy)的裸鼠主要脏器情况良好，未出现明显异常；而其余X射线照射各组(对照组和照射剂量超过0.19Gy的实验组)中，主要脏器都会出现一定程度的损伤。
本文主要结论与创新点主要有以下四个方面：
(1)对现有的“共沉淀”法进行了改进，成功制备出了均匀球形、粒径分布均匀、具备单分散性的β-NaGdF4:15%Tb3+和β-NaLuF4:15%Tb3+发光纳米粒，其平均粒径分别约为9nm和28nm，可有效增强EPR效应从而提高细胞胞吞效率，使得发光纳米粒可以有效地富集在肿瘤部位，同时，这两种纳米粒的X射线激发发射光谱最高发射峰位于545nm处，可与玫瑰红的吸收光谱高度吻合，且光产额较高，为X射线激发发光纳米粒—光敏剂耦合系统的研制提供了高效的发光核心。
(2)通过配体交换方式，使用AEP分别对β-NaGdF4:15%Tb3+和β-NaLuF4:15%Tb3+纳米粒表面包裹的油酸基团进行了修饰，使其具备较好的生物安全性，并通过研究发光纳米粒与光敏剂的耦合机理，成功制备出了具备高FRET效率(99.63%和94.29%)的β-NaREF4:15%Tb3+NPs@AEP-RB(RE=Gd，Lu)耦合系统。
(3)分别使用低剂量X射线照射(1.76 Gy，0.87 Gy)不同耦合系统治疗组，体外实验测得人体肝癌HepG2细胞的存活率分别为20%(β-NaGdF4:15%Tb3+NPs@AEP-RB)和10%(β-NaLuF4:15%Tb3+NPs@AEP-RB)。
(4)依托裸鼠异位移植肿瘤模型，体内实验得出β-NaGdF4:15%Tb3+NPs@AEP-RB耦合系统在低剂量(总计1Gy)X射线照射下，平均抑瘤率为60%，而β-NaLuF4:15%Tb3+NPs@AEP-RB耦合系统在较低剂量(总计0.19Gy)X射线照射下，抑瘤率可达到80%±12.3%。
由于X射线具有较好的组织穿透性，利用其间接激发纳米粒(nanoparticles，NPs)上搭载的光敏剂产生大量活性氧物种，从而诱导肿瘤细胞凋亡，这种新的光动力学治疗模式被称为“X射线激发光动力学治疗(X-ray excitedphotodynamic therapy， X-PDT)”。近年来，随着基于X射线激发发光纳米材料的发展为X-PDT带来了新纪元，X射线激发发光纳米粒—光敏剂耦合系统可提高活性氧物种的产生率，从而有效提升了肿瘤的治疗效果。目前，用于X-PDT的纳米材料主要有基于稀土金属闪烁发光纳米粒和基于金属硫/氧化物(金属)半导体发光纳米粒，由于应用于X-PDT的发光纳米粒仍存在着材料尺寸过大、粒径分布不均、形状不规则、性质不稳定等问题，导致出现纳米药物肿瘤富集率不高、极易受外界生物环境影响而分解、能量从X射线传递到光敏剂的效率较低以及X射线照射剂量过高等现象。所以，为了能够使低剂量X-PDT真正应用于临床治疗，必须解决以下三个关键问题：①如何制备出粒径尺寸适宜的(≦100nm)X射线激发发光纳米粒(X-ray excited luminescence nanoparticles，XLNPs)，使其能通过高通透性和滞留(enhancedpermeability and retentio，EPR)效应有效地富集在肿瘤部位？②如何制备出发光强度更高的X射线激发发光纳米粒？③如何设计并制备出荧光能量共振转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)效率高且生物安全性好的发光纳米粒—光敏剂耦合系统，从而有效降低X-PDT过程中X射线的照射剂量？
针对上述问题，本论文的主要研究内容有以下四个方面：
(1)X射线激发发光纳米材料的研究。针对目前X射线激发发光纳米粒存在的尺寸过大、粒径不均匀、形状不规则、发光弱等问题，我们采用“共沉淀”法成功制备出了三大类型的下转换发光纳米材料，包括β-NaGdF4:X%Tb3+纳米粒(X=3，5，7，12，15，18，22mol%)，NaLuF4:X%Tb3+纳米粒(X=3，6，9，12，15，18，21mol%)和NaLuF4:X%Gd3+15%Eu3+纳米粒(X=5，10，15，20，25，30mol%)，其具有良好的油溶特性。通过改变反应温度、反应时间、发光中心掺杂比例以及氟源与钠源的摩尔比例等反应参数，我们对每个制备过程中的反应机理、粒径与形貌控制以及发光强度进行了分析与讨论。综合利用TEM、HR-TEM、SEM、XRD、EDS和荧光分光光度计等仪器设备对制备出的纳米材料进行了形貌、晶格结构等表征分析及X射线激发发射光谱分析得出，β-NaGdF4:15%Tb3+纳米粒尺寸较小(9nm左右)，而β-NaLuF4:15%Tb3+纳米粒尺寸虽然稍大(28 nm)，但是其发光强度更高，约是前者的7倍，这两种类型发光纳米粒中掺杂的Tb3+离子特征发射峰与二代成熟光敏剂玫瑰红(rosebengal，RB)的吸收光谱高度匹配。此外，NaLuF4:X%Gd3+15%Eu3+纳米粒(X=5，10，15，20，25，30mol%)的发光强度较低，其中掺杂的Eu3+离子特征发射峰与玫瑰红的吸收光谱匹配程度较低。因此，我们从中优选出β-NaGdF4:15%Tb3+和β-NaLuF4:15%Tb3+纳米粒用于后续实验研究。
(2)X射线激发发光纳米粒—光敏剂耦合系统制备及其单态氧产生率的研究。由于通过“共沉淀”法初步制备的发光纳米粒表面被油酸基团包覆，无法在水溶液中进行分散，不能直接应用于生物医药领域。因此，首先通过配体交换的方式，将发光纳米粒表面的油酸基团置换为2—氨基乙基膦酸(2-aminoethylphosphonic acid， AEP)，以使其具备良好的水溶性和生物安全性，为后续与光敏剂的耦合做好准备，并通过测量傅里叶转换红外光谱(Fourier-transform infrared spectroscopy，FT-IR)确定了AEP的成功置换。然后，为了使发光纳米粒—光敏剂耦合系统具备高效FRET效率以生成较多的单态氧用于X-PDT，我们分别采用“静电吸附”和“共价耦合”的方式，将经过AEP修饰后的β-NaREF4:15%Tb3+(RE=Gd，Lu)纳米粒与玫瑰红进行联接，通过研究两种方式的机理得出，“共价耦合”方式制备出的发光纳米粒—玫瑰红耦合系统可耦合较多的玫瑰红，且FRET效率更高。再者，通过改变发光纳米粒与玫瑰红的配比制得不同的β-NaREF4:15%Tb3+NPs@AEP-RB(RE=Gd，Lu)耦合系统，测算其FRET效率得出，当纳米粒与玫瑰红的质量比值为20∶1和19.53125∶1时，两种耦合系统的FRET效率可达最大值，分别为99.63%和94.29%。最后，利用1，3—二苯基异苯并呋喃(1，3-diphenylisobenzofuran，DPBF)对不同浓度耦合系统的单态氧生成情况进行测算得出，在X射线照射下，两种耦合系统均可产生大量的单态氧，且其在溶液中的单态氧产生率随着耦合光敏剂的量的增加而增加。
(3)X射线激发发光纳米粒—光敏剂耦合系统的体外X-PDT评价研究。为了有效评价X射线激发发光纳米粒—光敏剂耦合系统的体外生物安全性、EPR效应引起的胞吞效率及体外X-PDT疗效，我们选取HepG2肝癌细胞对β-NaREF4:15%Tb3+(RE=Gd，Lu)纳米粒进行了胞吞实验，证明其可以顺利进至细胞内部，且随着时间增加，胞吞数量也随之增多。通过将不同浓度的β-NaREF4:15%Tb3+NPs@AEP-RB(RE=Gd，Lu)耦合系统与HepG2细胞共同孵育24h之后测得，两种类型耦合系统均具备较好的生物安全性。此外，将两种类型耦合系统分别与HepG2肝癌细胞共同孵育10h后，经X射线照射1.5h，检测得到细胞存活率分别为20%(β-NaGdF4:15%Tb3+NPs@AEP-RB)和10%(β-NaLuF4:15%Tb3+NPs@AEP-RB)。同时，使用2，7—二氯荧光黄双乙酸盐(2′，7′-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA)可检测到细胞内部均有单态氧存在，证实了肿瘤细胞的凋亡是由单态氧所引起的。这些为后续的裸鼠体内荷瘤实验奠定了基础。
(4)X射线激发发光纳米粒—光敏剂耦合系统的体内X-PDT评价研究。为了有效评价X射线激发发光纳米粒—光敏剂耦合系统的体内生物安全性及X-PDT疗效，我们依托在裸鼠大腿部位建立的HepG2肝癌细胞异位移植肿瘤模型，测算不同实验组的X射线照射剂量发现，β-NaGdF4:15%Tb3+NPs@AEP-RB耦合系统在低剂量(0.25Gy/次，照射4次，总计1Gy)X射线照射下，其平均抑瘤率为60%，而β-NaLuF4:15%Tb3+NPs@AEP-RB耦合系统在更低剂量(0.19Gy/次，照射1次，总计0.19Gy)X射线照射下，其抑瘤率可达到80%±12.3%。通过对比分析了不同分组的肿瘤重量、大小得出，实验组(耦合系统组)在不同X射线照射时间下均呈现出了较为理想的治疗效果。对上述两种类型耦合系统实验组瘤体的石蜡切片通过TUNEL染色发现，经X射线照射后，实验组(耦合系统组)的肿瘤细胞凋亡最为严重，且出现大面积坏死区域。同时，使用HE染色法观察各组裸鼠主要脏器发现，未经X射线照射的各组及单次照射20min组(0.19 Gy)的裸鼠主要脏器情况良好，未出现明显异常；而其余X射线照射各组(对照组和照射剂量超过0.19Gy的实验组)中，主要脏器都会出现一定程度的损伤。
本文主要结论与创新点主要有以下四个方面：
(1)对现有的“共沉淀”法进行了改进，成功制备出了均匀球形、粒径分布均匀、具备单分散性的β-NaGdF4:15%Tb3+和β-NaLuF4:15%Tb3+发光纳米粒，其平均粒径分别约为9nm和28nm，可有效增强EPR效应从而提高细胞胞吞效率，使得发光纳米粒可以有效地富集在肿瘤部位，同时，这两种纳米粒的X射线激发发射光谱最高发射峰位于545nm处，可与玫瑰红的吸收光谱高度吻合，且光产额较高，为X射线激发发光纳米粒—光敏剂耦合系统的研制提供了高效的发光核心。
(2)通过配体交换方式，使用AEP分别对β-NaGdF4:15%Tb3+和β-NaLuF4:15%Tb3+纳米粒表面包裹的油酸基团进行了修饰，使其具备较好的生物安全性，并通过研究发光纳米粒与光敏剂的耦合机理，成功制备出了具备高FRET效率(99.63%和94.29%)的β-NaREF4:15%Tb3+NPs@AEP-RB(RE=Gd，Lu)耦合系统。
(3)分别使用低剂量X射线照射(1.76 Gy，0.87 Gy)不同耦合系统治疗组，体外实验测得人体肝癌HepG2细胞的存活率分别为20%(β-NaGdF4:15%Tb3+NPs@AEP-RB)和10%(β-NaLuF4:15%Tb3+NPs@AEP-RB)。
(4)依托裸鼠异位移植肿瘤模型，体内实验得出β-NaGdF4:15%Tb3+NPs@AEP-RB耦合系统在低剂量(总计1Gy)X射线照射下，平均抑瘤率为60%，而β-NaLuF4:15%Tb3+NPs@AEP-RB耦合系统在较低剂量(总计0.19Gy)X射线照射下，抑瘤率可达到80%±12.3%。