肺岩宁颗粒对人非小细胞肺癌细胞A549Wnt/β-catenin信号通路调控机制的研究

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目的:  探讨肺岩宁颗粒对人非小细胞肺癌细胞A549 Wnt/β-catenin信号通路调控机制的研究.  方法:  1、采用醇沉法制备肺岩宁颗粒提取液;  2、MTT实验设置中药提取液6组,终浓度分别为2.5mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、40mg/ml和80mg/ml,观察A549肺癌细胞对不同浓度的肺岩宁颗粒提取液的敏感性,并筛选出两个合适的浓度。将筛选出的合适的两个浓度,与顺铂组(DDP组,终浓度6ug/ml)、β-catenin抑制组(XAV939组,终浓度1μmol/L)、空白对照组(加PBS液)共5组进行下面的实验;  3、流式细胞仪检测A549细胞的凋亡与细胞周期变化;  4、Real-time PCR检测各组细胞β-catenin、c-myc、Cyclin D1、Survivin、CD44mRNA的表达;  5、Western blot检测各组细胞β-catenin、c-myc、Cyclin D1、Survivin、CD44蛋白的表达。  结果:  1、MTT实验显示肺岩宁颗粒提取液作用于A549肺癌细胞24h、48h、72h后,OD值均随着用药浓度的升高而降低,说明中药提取液对A549细胞的增殖存在量效趋势的抑制作用,各组与正常PBS组比较,差异均有统计学意义(P≤0.05);抑制率随着中药浓度的增加和作用时间的延长而增加;A549细胞用药24小时的IC50值为6.51 mg/ml,用药48小时的IC50值为3.50mg/ml和72小时IC50值为2.39mg/ml。为了进一步研究肺岩宁颗粒提取液对A549肺癌细胞的作用机制,选择24h为作用时间点,中药2.5mg/ml和中药5mg/ml两个浓度做进一步研究;  2、药物作用24h后,各用药组与PBS正常组比较,凋亡率均有明显上升(P≤0.01),以早期凋亡为主;中药5mg/ml组的细胞凋亡率明显高于中药2.5mg/ml组(P≤0.01);  3、药物作用24h后,各用药组与正常PBS组对比,细胞百分比均在G1期下降, S期上升,差异均有统计学意义(P≤0.01),G2期细胞百分比无明显差异(P>0.05);在G2期,中药5mg/ml组和DDP组的细胞百分比明显低于中药2.5mg/ml组比较(P≤0.01);  4、与PBS正常组比较,在中药浓度为2.5mg/ml时,能显著下调c-myc mRNA和蛋白的表达以及Survivin、CD44的蛋白表达(P≤0.05);当中药浓度达到5mg/ml时能显著下调β-catenin、c-myc、CD44 mRNA和蛋白的表达以及Cyclin D1、Survivin蛋白的表达(P≤0.05);6μg/ml浓度的DDP能显著下调β-catenin、Survivin mRNA的表达(P≤0.05),而对β-catenin、c-myc、Survivin、Cyclin D1、CD44蛋白的表达虽能下调,但差异无统计学意义(P>0.05);1μmol/ml的β-catenin抑制剂XAV939能显著下调β-catenin、c-myc、Survivin、Cyclin D1、CD44 mRNA的表达以及CD44蛋白的表达(P≤0.05)。  结论:  1、肺岩宁颗粒可有效抑制肺癌A549细胞的恶性增殖,并且抑制率随着浓度和作用时间的增加而增加;  2、肺岩宁颗粒诱导A549肺癌细胞的凋亡,主要以早期凋亡为主,并且与浓度呈正相关;并能将A549肺癌细胞阻滞在S期;  3、肺岩宁颗粒是通过调控β-catenin以及Wnt信号通路下游靶基因c-myc、Survivin、Cyclin D1的表达而起到抑制A549肺癌细胞恶性增殖,促进癌细胞凋亡;降低CD44基因的表达而达到抗肿瘤转移的作用。  4、XAV939则是通过抑制β-catenin的表达而起到抑制Wnt信号下游靶基因的表达;  5、6μg/ml浓度的DDP能诱导A549肺癌细胞发生早期凋亡,并能显著下调β-catenin、Survivin mRNA的表达。
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