脑缺血是威胁人类健康的主要疾病之一，对患者及其家庭带来沉重的负担。双光子活体成像发现全脑缺血再灌注后皮层浅层神经元树突结构受到严重损伤及其上的树突棘会发生急剧的变化。这些研究主要聚焦于皮层浅层神经元结构的动态变化，而缺血再灌注早期更深皮层区域内的神经元具体的结构变化无法探究，尤其是树突棘的相关变化。本实验利用野生型小鼠C57/BL6和特异性标记大脑皮层第五层锥体神经元的转基因小鼠Thy1-YFPH-line，通过双侧颈总动脉结扎手术建立全脑缺血再灌注模型。将实验组分为Sham组、BCAL3h组、Rep0.5h组、Rep1h组和Rep2h组。采用组织染色、免疫荧光染色和共聚焦显微成像等实验手段来探究再灌注早期大脑皮层深层神经元结构以及树突棘的变化。
　　我们通过共聚焦显微成像方法研究了小鼠大脑第五层锥体神经元缺血3h再灌注0h、0.5h、1h和2h不同时间点的神经元结构变化。结果发现，与Sham组相比较，BCAL3h组发生严重的缺血损伤，第五层锥体神经元树突呈明显的念珠状；与BCAL3h组相比较，Rep0.5h组、Rep1h组和Rep2h组神经元树突念珠状损伤结构由胞体端到远胞体端逐渐开始恢复。尼氏染色结果显示，与Sham组相比较，BCAL3h组、Rep0.5h组、Rep1h组和Rep2h组在大脑皮层、海马CA1区及纹状体区中尼氏体密度均显著性下降；Rep0.5h组、Rep1h组和Rep2h组与BCAL3h组相比较，仅在纹状体区的尼氏体密度显著性下降。Fluoro-JadeC染色结果发现，Sham组中小鼠皮层区未出现FJC阳性细胞。缺血3h后，小鼠皮层区神经元开始发生退行性病变，出现少量的FJC阳性细胞。与BCAL3h组相比较，再灌注2h内FJC阳性细胞密度上升，且存在显著性。为了进一步探究神经元结构是否恢复，通过Sholl分析结果表明，Sham组中锥体神经元树突结构完整，BCAL3h组、Rep0.5h组、Rep1h组和Rep2h组中锥体神经元主树突以及侧树突均出现明显的念珠状损伤。Rep0.5h组、Rep1h组和Rep2h组相比于BCAL3h组，最大相交点数、平均相交点数和半径临界值均增加，树突分支结构在再灌注早期开始恢复，与共聚焦显微成像结果相一致。有趣的是，主树突树突棘密度统计分析发现，再灌注期间内不同区段的树突棘密度变化不同。BCAL3h组与Sham组相比较，各个区间段的树突棘密度均显著性下降。Rep0.5h组、Rep1h组和Rep2h组相比于BCAL3h组，从神经元胞体到距胞体300μm区间内主树突树突棘密度无显著性变化，而距胞体300μm到600μm区间内随着再灌注时间的延长树突棘密度显著性上升，且在再灌注1h到2h间存在峰值。此外突触蛋白免疫荧光结果显示，相比于Sham组，缺血3h后突触前囊泡结合蛋白Syn1和突触后膜脚手架蛋白PSD95在小鼠皮层区密度显著性下降。相比于BCAL3h组，再灌注2h内突触前囊泡结合蛋白Syn1和突触后膜脚手架蛋白PSD95密度均显著性上升。
　　本实验发现在双侧颈总动脉全脑缺血模型中长时间缺血会对小鼠神经元造成严重损伤，再灌注早期内神经元树突分支念珠状损伤由胞体端向顶端树突方向开始恢复，远胞体端主树突树突棘增多，突触蛋白表达上调，突触数量增多。以上研究为今后脑缺血神经元结构变化以及开发新的神经保护剂提供新的理论依据。