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食管癌（esophageal cancer，EC）是最常见的消化道癌症之一，在我国，食管鳞状细胞癌（食管鳞癌，esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）患者占食管癌患者的90%以上，因起病隐匿，早期症状不明显，许多患者初诊时已处于晚期，预后较差。肿瘤相关抗原（tumor associated antigen，TAA）自身抗体可在肿瘤患者的血清中稳定存在，并可以在临床症状出现的数月甚至数年之前被检测到，因此，具有作为肿瘤早期免疫诊断标志物的潜力。
目的:
本研究通过定制癌症驱动基因编码的蛋白芯片和对GEO数据库中食管鳞癌相关数据集的生物信息学分析，结合酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）技术，对食管鳞癌相关自身抗体进行筛选和验证，探索最优的食管鳞癌诊断模型，为建立一种非侵入性的食管鳞癌早期诊断技术提供一定的科学依据。
方法:
1.蛋白质芯片筛选食管鳞癌相关抗原
基于癌症驱动基因编码的蛋白质定制Focused array人类蛋白质芯片，检测90例食管鳞癌患者（均为初次就诊且未接受任何治疗）和50例正常人血清中的抗TAA自身抗体的表达水平。采用受试者工作特征（ROC）曲线（AUC＞0.5，P＜0.05）和非参数检验（病例组平均秩次＞对照组平均秩次，P＜0.05）筛选在病例组中高表达的肿瘤相关抗原。
2.GEO数据库筛选食管鳞癌相关抗原
使用R语言中limma包的经典贝叶斯算法对GEO数据库中符合纳入标准的食管鳞癌数据集进行差异分析（差异倍数＞2，P＜0.05），筛选在食管鳞癌组织中表达明显高于食管正常组织的差异基因，通过富集分析、GEPIA数据库验证和文献查阅筛选与癌症发生发展密切相关的肿瘤相关抗原。
3.ELISA确认抗TAA自身抗体对食管鳞癌的诊断价值
使用PASS软件进行样本量计算，最终纳入486例研究对象，病例组和对照组按照性别和年龄（±3岁）进行1∶1匹配。将243例食管鳞癌患者（均为初次就诊且未接受任何治疗）和243例正常对照血清，按照2∶1的比例随机分为训练集和验证集，采用ELISA检测抗TAA自身抗体在研究对象血清中的表达水平。采用非参数检验比较食管鳞癌组和正常对照组中抗TAA自身抗体的表达水平。以特异度＞90%且约登指数最大时的吸光度值为截断值，运用ROC曲线评估每种抗TAA自身抗体对食管鳞癌的诊断价值，评价指标包括灵敏度、特异度、AUC和符合率等。
4.食管癌诊断模型的构建与评价
以具有诊断价值的自身抗体的表达水平为自变量，以研究对象是否患有食管鳞癌事件作为因变量，采用Logistic回归分析、递归分割分析和支持向量机在训练集中构建诊断模型，同时在验证集中评价不同模型的诊断价值；利用Delong检验比较AUC的差异是否具有统计学意义。通过比较模型的诊断性能和稳定性，选择最优的诊断模型，评价该模型在食管鳞癌亚组（包括分化程度、TNM分期、有无淋巴结转移和有无远端转移）中的诊断价值。
结果:
1.通过蛋白芯片技术筛选出5种候选TAA，分别为P53、PTEN、GNA11、GNAS和SRSF2（P＜0.05），相应的自身抗体对食管鳞癌诊断的AUC分别为0.628(95%CI:0.535-0.721)、0.659(95%CI:0.564-0.754)、0.682(95%CI:0.588-0.776)、0.606(95%CI:0.511-0.701)和0.623(95%CI:0.522-0.723)。
2.对食管鳞癌相关的数据集GSE20347和GSE2340的差异分析，获得196种在食管鳞癌中高表达的差异基因，进一步对差异基因的富集分析获得15种与癌症通路有关的基因，综合GEPIA数据库验证结果和查阅相关文献确定9种候选基因，将其编码的相应蛋白作为候选TAA，分别为MSH6、COL4A1、MMP9、CXCL8、MMP1、CKS2、LAMC2、FN1和SLC2A1。
3.本研究共评价14种抗TAA自身抗体对食管鳞癌的诊断价值，ELISA结果显示，9种抗TAA自身抗体（P53、PTEN、GNA11、SRSF2、MSH6、CXCL8、MMP1、LAMC2和SLC2A1）在食管鳞癌组的表达水平均高于正常对照组（P＜0.05）。其中，抗-LAMC2自身抗体的诊断价值最高，在训练集和验证集中诊断食管鳞癌的灵敏度和特异度分别为22.22%、90.12%和23.46%、90.12%。
4.在构建的Logistic回归模型、决策树模型和支持向量机模型中，最优的诊断模型为包含4种抗TAA自身抗体的Logistic回归模型，PRE(P=ESCC)=1/(1+EXP(?(?6.355-3.293×SLC2A1+7.063×MMP1+4.559×P53+10.545×GNA11)))，该模型在训练集和验证集中诊断食管鳞癌的灵敏度、特异度和符合率分别为70.37%、72.84%、71.60%和67.90%、67.90%、67.90%。
5.临床特征分析结果显示，该模型对早期食管鳞癌具有较高的诊断价值，在训练集和验证集中诊断早期和晚期食管鳞癌的AUC分别为0.84、0.85和0.72、0.73。该模型在用于鉴别不同分化程度、有无淋巴结转移以及有无远端转移食管鳞癌的能力上，差异没有统计学意义（P＞0.05）。
结论:
1.9种抗TAA自身抗体（P53、PTEN、GNA11、SRSF2、MSH6、CXCL8、MMP1、LAMC2和SLC2A1）均可能为食管鳞癌免疫诊断的标志物。
2.在构建的诊断模型中，由4种抗TAA自身抗体（SLC2A1、MMP1、P53和GNA11）组成的Logistic回归模型对早期食管鳞癌有较高的诊断价值。
目的:
本研究通过定制癌症驱动基因编码的蛋白芯片和对GEO数据库中食管鳞癌相关数据集的生物信息学分析，结合酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）技术，对食管鳞癌相关自身抗体进行筛选和验证，探索最优的食管鳞癌诊断模型，为建立一种非侵入性的食管鳞癌早期诊断技术提供一定的科学依据。
方法:
1.蛋白质芯片筛选食管鳞癌相关抗原
基于癌症驱动基因编码的蛋白质定制Focused array人类蛋白质芯片，检测90例食管鳞癌患者（均为初次就诊且未接受任何治疗）和50例正常人血清中的抗TAA自身抗体的表达水平。采用受试者工作特征（ROC）曲线（AUC＞0.5，P＜0.05）和非参数检验（病例组平均秩次＞对照组平均秩次，P＜0.05）筛选在病例组中高表达的肿瘤相关抗原。
2.GEO数据库筛选食管鳞癌相关抗原
使用R语言中limma包的经典贝叶斯算法对GEO数据库中符合纳入标准的食管鳞癌数据集进行差异分析（差异倍数＞2，P＜0.05），筛选在食管鳞癌组织中表达明显高于食管正常组织的差异基因，通过富集分析、GEPIA数据库验证和文献查阅筛选与癌症发生发展密切相关的肿瘤相关抗原。
3.ELISA确认抗TAA自身抗体对食管鳞癌的诊断价值
使用PASS软件进行样本量计算，最终纳入486例研究对象，病例组和对照组按照性别和年龄（±3岁）进行1∶1匹配。将243例食管鳞癌患者（均为初次就诊且未接受任何治疗）和243例正常对照血清，按照2∶1的比例随机分为训练集和验证集，采用ELISA检测抗TAA自身抗体在研究对象血清中的表达水平。采用非参数检验比较食管鳞癌组和正常对照组中抗TAA自身抗体的表达水平。以特异度＞90%且约登指数最大时的吸光度值为截断值，运用ROC曲线评估每种抗TAA自身抗体对食管鳞癌的诊断价值，评价指标包括灵敏度、特异度、AUC和符合率等。
4.食管癌诊断模型的构建与评价
以具有诊断价值的自身抗体的表达水平为自变量，以研究对象是否患有食管鳞癌事件作为因变量，采用Logistic回归分析、递归分割分析和支持向量机在训练集中构建诊断模型，同时在验证集中评价不同模型的诊断价值；利用Delong检验比较AUC的差异是否具有统计学意义。通过比较模型的诊断性能和稳定性，选择最优的诊断模型，评价该模型在食管鳞癌亚组（包括分化程度、TNM分期、有无淋巴结转移和有无远端转移）中的诊断价值。
结果:
1.通过蛋白芯片技术筛选出5种候选TAA，分别为P53、PTEN、GNA11、GNAS和SRSF2（P＜0.05），相应的自身抗体对食管鳞癌诊断的AUC分别为0.628(95%CI:0.535-0.721)、0.659(95%CI:0.564-0.754)、0.682(95%CI:0.588-0.776)、0.606(95%CI:0.511-0.701)和0.623(95%CI:0.522-0.723)。
2.对食管鳞癌相关的数据集GSE20347和GSE2340的差异分析，获得196种在食管鳞癌中高表达的差异基因，进一步对差异基因的富集分析获得15种与癌症通路有关的基因，综合GEPIA数据库验证结果和查阅相关文献确定9种候选基因，将其编码的相应蛋白作为候选TAA，分别为MSH6、COL4A1、MMP9、CXCL8、MMP1、CKS2、LAMC2、FN1和SLC2A1。
3.本研究共评价14种抗TAA自身抗体对食管鳞癌的诊断价值，ELISA结果显示，9种抗TAA自身抗体（P53、PTEN、GNA11、SRSF2、MSH6、CXCL8、MMP1、LAMC2和SLC2A1）在食管鳞癌组的表达水平均高于正常对照组（P＜0.05）。其中，抗-LAMC2自身抗体的诊断价值最高，在训练集和验证集中诊断食管鳞癌的灵敏度和特异度分别为22.22%、90.12%和23.46%、90.12%。
4.在构建的Logistic回归模型、决策树模型和支持向量机模型中，最优的诊断模型为包含4种抗TAA自身抗体的Logistic回归模型，PRE(P=ESCC)=1/(1+EXP(?(?6.355-3.293×SLC2A1+7.063×MMP1+4.559×P53+10.545×GNA11)))，该模型在训练集和验证集中诊断食管鳞癌的灵敏度、特异度和符合率分别为70.37%、72.84%、71.60%和67.90%、67.90%、67.90%。
5.临床特征分析结果显示，该模型对早期食管鳞癌具有较高的诊断价值，在训练集和验证集中诊断早期和晚期食管鳞癌的AUC分别为0.84、0.85和0.72、0.73。该模型在用于鉴别不同分化程度、有无淋巴结转移以及有无远端转移食管鳞癌的能力上，差异没有统计学意义（P＞0.05）。
结论:
1.9种抗TAA自身抗体（P53、PTEN、GNA11、SRSF2、MSH6、CXCL8、MMP1、LAMC2和SLC2A1）均可能为食管鳞癌免疫诊断的标志物。
2.在构建的诊断模型中，由4种抗TAA自身抗体（SLC2A1、MMP1、P53和GNA11）组成的Logistic回归模型对早期食管鳞癌有较高的诊断价值。