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目的：通过高速液相色谱得到补肾运脾方成分的含量，使用生物信息分析获得方药治疗绝经后骨质疏松症的作用靶点基因，并通过补肾运脾方对(脾肾两虚型)绝经后骨质疏松患者中医症候积分、骨代谢标记物、血生化指标等临床疗效指标及该方对斑马鱼骨质疏松模型的骨保护作用，探索补肾运脾方的骨保护机制。
方法：药物有效成分分析部分：将补肾运脾方四味主要药物(绞股蓝30g、淫羊藿20g、鸡血藤20g、枸杞子20g)分别进行常规水煎煮和甲醇回流提取后通过高效液相色谱法测定煎煮后药物有效成分的实际含量，并通过色谱图展示，试验重复3-5次，取最稳定曲线图谱。生物信息分析部分：第一步在NCBI基因数据库寻找PMOP基因靶点并记录为数据集Ⅰ，第二步在中药基因数据库BATM AN-TCM、TCMSP寻找四味药物可能干预的效应基因数据集Ⅱ，第三步数据集Ⅰ和数据集Ⅱ取交集获得核心靶基因数据集Ⅲ，第四步通过STRING平台对核心靶点基因数据集Ⅲ实行PPI分析，扩大分析后得到数据库A，得到GO分析(分子功能)、GO分析(生物过程)、Pathway分析(信号通路)，后使用Cytoscape软件对数据库A行核心基因分析，得出核心基因及其所处的信号通路，为后续临床实验寻找实验室指标。临床观察部分：将契合纳入标准的60例病人按照平行对照、随机、非盲法分组，进行治疗，每组各30例，对照组给予抗骨质疏松西药治疗，碳酸钙D3，0.6g，qd;阿法骨化醇0.5ug qd。治疗组在对照组的基础上，使用补肾运脾方口服tid，周期为3个月，完成后分别比较患者治疗前后的中医症候评分、骨密度、血清OPG、RANKL、LEP及血生化指标(血清ALP、Ca)的变化。动物实验部分：将补肾运脾方(颗粒剂)溶解在0.5％的DMSO中溶解，制备成含生药浓度为(100、200、400、800ug/mL)的溶液中，观察斑马鱼的孵化和死亡情况，得出补肾运脾方对斑马鱼安全的剂量，在安全剂量以下梯度浓度(DMSO、25、50、100ug/mL)补肾运脾方对斑马鱼骨质疏松模型进行干预，第9天，通过茜素红染色，显微镜下观察并保持图片，通过Image Plus Plus6.0获得斑马鱼幼鱼的头骨茜素红染色后，头骨染色的面积(Area)和累积光密度总和(IOD)，探讨补肾运脾方对斑马鱼骨质疏松模型骨保护的作用。
结果：1.药物有效成分分析：中药汤剂溶液中绞股蓝的主要有效成分是绞股蓝皂苷，淫羊藿的主要有效成分是淫羊藿苷，枸杞子的主要有效成分是甜菜碱，鸡血藤的主要有效成分是表儿茶素;甜菜碱在质量范围3-11ug内线性良好，表儿茶素在质量范围为0.0294-0.2646ug内线性良好，淫羊藿苷在质量范围为0.097-0.485ug内线性良好，绞股蓝皂苷XLIX在质量范围为0.0291-0.291ug内线性良好。水煎煮提取法中：总提取物中含甜菜碱458.279mg、表儿茶素4.546mg、淫羊藿苷9.863mg、绞股蓝皂苷XLIX2.997mg;甲醇回流提取法中：复方中含甜菜碱390.62mg、表儿茶素14.52mg、淫羊藿苷8.06mg、绞股蓝皂苷XLIX33.2mg。
2.生物信息分析：通过NCBI数据库得到绝经后骨质疏松基因数243个、绞股蓝252个、淫羊藿376个、枸杞子1342个、鸡血藤473个，四味药物与PMO P交集基因21个，分别为NOS2、PON1、CYP1A1、PPARG、PRKCD、GSTP1、CNR1、PTGS2、ESR1、ADRB2、IL6、VDR、CNR2、ERBB2、PGR、CYP17A1、SERPINE1、IL1B、AR、ESR2、BAX，他们主要富集于PI3K/AKT信号轴中，调控细胞凋亡，对数据集扩大分析后，MCODE分析得出核心为IL6、BCL2。
3.临床观察部分：①临床总疗效：治疗3个月后：治疗组30例患者，显效3例，有效19例，无效8例，有效率73.3％;对照组30例患者，显效1例，有效13例，无效16例，有效率46.7％。两组经3个月治疗后临床总疗效相比较，具有统计学意义(P＜0.05)。说明含补肾运脾方+西药临床疗效优于单纯西药。②中医症候积分方面：3个月治疗后，在中医症候积分方面，治疗组较对照组改善明显(P＜0.05)。③血清OPG、RANKL、LEP方面：3个月治疗后，患者血清OPG、RANKL、LEP水平较同组治疗前均存在统计学意义(P＜0.05)：治疗组血清OPG、RANKL、LEP较对照组组间比较具有统计学意义(P＜0.05)。④生化指标方面：3个月后，患者血清Ca、ALP较治疗前对比差异有统计学意义(P＜0.05)，治疗组治疗后血清Ca较对照组比较具有统计学意义(P＜0.05)。⑤骨密度方面：两组经3个月治疗后患者骨密度检测差异无统计学意义(P＞0.05)。
4.动物实验部分：斑马鱼幼鱼对补肾运脾方的最大耐受药物浓度为100ug/m L，在此浓度中斑马鱼存活率与DMSO组无差异(P＜0.05)，泼尼松龙诱导斑马鱼骨质疏松模型的最佳浓度为25ug/mL，与DMSO对照组相比，泼尼松龙处理的模型对照组的斑马鱼茜素红头骨染色面积(Area)及累积光密度总和(IOD)均明显降低，对比具有统计学意义(P＜0.05)：与模型对照组相比，25、50、100ug/mL补肾运脾方均能增加斑马鱼茜素红头骨染色面积(Area)及累积光密度总和(IOD)，比较具有统计学意义(P＜0.05)，其中100ug/mL浓度能显著增加斑马鱼茜素红头骨染色面积(Area)及累积光密度总和(IOD)，比较具有统计学意义(P＜0.001)。
结论：补肾运脾方经过煎煮后的主要有效成分是绞股蓝皂苷、淫羊藿苷、甜菜碱、表儿茶素，其在方药中是稳定存在且量好的;其可能作用机制是通过刺激IL-6、BCL2调节P13K/AKT信号的来防治PMOP;且补肾运脾方能有效减低(脾肾两虚型)PMOP患者血清RANKL、ALP水平，提高血清LEP、OPG、Ca水平，明显改善(脾肾两虚型)PMOP患者中医症候积分;也对斑马鱼骨质疏松动物模型有较好的骨保护，且呈浓度梯度依赖型。
方法：药物有效成分分析部分：将补肾运脾方四味主要药物(绞股蓝30g、淫羊藿20g、鸡血藤20g、枸杞子20g)分别进行常规水煎煮和甲醇回流提取后通过高效液相色谱法测定煎煮后药物有效成分的实际含量，并通过色谱图展示，试验重复3-5次，取最稳定曲线图谱。生物信息分析部分：第一步在NCBI基因数据库寻找PMOP基因靶点并记录为数据集Ⅰ，第二步在中药基因数据库BATM AN-TCM、TCMSP寻找四味药物可能干预的效应基因数据集Ⅱ，第三步数据集Ⅰ和数据集Ⅱ取交集获得核心靶基因数据集Ⅲ，第四步通过STRING平台对核心靶点基因数据集Ⅲ实行PPI分析，扩大分析后得到数据库A，得到GO分析(分子功能)、GO分析(生物过程)、Pathway分析(信号通路)，后使用Cytoscape软件对数据库A行核心基因分析，得出核心基因及其所处的信号通路，为后续临床实验寻找实验室指标。临床观察部分：将契合纳入标准的60例病人按照平行对照、随机、非盲法分组，进行治疗，每组各30例，对照组给予抗骨质疏松西药治疗，碳酸钙D3，0.6g，qd;阿法骨化醇0.5ug qd。治疗组在对照组的基础上，使用补肾运脾方口服tid，周期为3个月，完成后分别比较患者治疗前后的中医症候评分、骨密度、血清OPG、RANKL、LEP及血生化指标(血清ALP、Ca)的变化。动物实验部分：将补肾运脾方(颗粒剂)溶解在0.5％的DMSO中溶解，制备成含生药浓度为(100、200、400、800ug/mL)的溶液中，观察斑马鱼的孵化和死亡情况，得出补肾运脾方对斑马鱼安全的剂量，在安全剂量以下梯度浓度(DMSO、25、50、100ug/mL)补肾运脾方对斑马鱼骨质疏松模型进行干预，第9天，通过茜素红染色，显微镜下观察并保持图片，通过Image Plus Plus6.0获得斑马鱼幼鱼的头骨茜素红染色后，头骨染色的面积(Area)和累积光密度总和(IOD)，探讨补肾运脾方对斑马鱼骨质疏松模型骨保护的作用。
结果：1.药物有效成分分析：中药汤剂溶液中绞股蓝的主要有效成分是绞股蓝皂苷，淫羊藿的主要有效成分是淫羊藿苷，枸杞子的主要有效成分是甜菜碱，鸡血藤的主要有效成分是表儿茶素;甜菜碱在质量范围3-11ug内线性良好，表儿茶素在质量范围为0.0294-0.2646ug内线性良好，淫羊藿苷在质量范围为0.097-0.485ug内线性良好，绞股蓝皂苷XLIX在质量范围为0.0291-0.291ug内线性良好。水煎煮提取法中：总提取物中含甜菜碱458.279mg、表儿茶素4.546mg、淫羊藿苷9.863mg、绞股蓝皂苷XLIX2.997mg;甲醇回流提取法中：复方中含甜菜碱390.62mg、表儿茶素14.52mg、淫羊藿苷8.06mg、绞股蓝皂苷XLIX33.2mg。
2.生物信息分析：通过NCBI数据库得到绝经后骨质疏松基因数243个、绞股蓝252个、淫羊藿376个、枸杞子1342个、鸡血藤473个，四味药物与PMO P交集基因21个，分别为NOS2、PON1、CYP1A1、PPARG、PRKCD、GSTP1、CNR1、PTGS2、ESR1、ADRB2、IL6、VDR、CNR2、ERBB2、PGR、CYP17A1、SERPINE1、IL1B、AR、ESR2、BAX，他们主要富集于PI3K/AKT信号轴中，调控细胞凋亡，对数据集扩大分析后，MCODE分析得出核心为IL6、BCL2。
3.临床观察部分：①临床总疗效：治疗3个月后：治疗组30例患者，显效3例，有效19例，无效8例，有效率73.3％;对照组30例患者，显效1例，有效13例，无效16例，有效率46.7％。两组经3个月治疗后临床总疗效相比较，具有统计学意义(P＜0.05)。说明含补肾运脾方+西药临床疗效优于单纯西药。②中医症候积分方面：3个月治疗后，在中医症候积分方面，治疗组较对照组改善明显(P＜0.05)。③血清OPG、RANKL、LEP方面：3个月治疗后，患者血清OPG、RANKL、LEP水平较同组治疗前均存在统计学意义(P＜0.05)：治疗组血清OPG、RANKL、LEP较对照组组间比较具有统计学意义(P＜0.05)。④生化指标方面：3个月后，患者血清Ca、ALP较治疗前对比差异有统计学意义(P＜0.05)，治疗组治疗后血清Ca较对照组比较具有统计学意义(P＜0.05)。⑤骨密度方面：两组经3个月治疗后患者骨密度检测差异无统计学意义(P＞0.05)。
4.动物实验部分：斑马鱼幼鱼对补肾运脾方的最大耐受药物浓度为100ug/m L，在此浓度中斑马鱼存活率与DMSO组无差异(P＜0.05)，泼尼松龙诱导斑马鱼骨质疏松模型的最佳浓度为25ug/mL，与DMSO对照组相比，泼尼松龙处理的模型对照组的斑马鱼茜素红头骨染色面积(Area)及累积光密度总和(IOD)均明显降低，对比具有统计学意义(P＜0.05)：与模型对照组相比，25、50、100ug/mL补肾运脾方均能增加斑马鱼茜素红头骨染色面积(Area)及累积光密度总和(IOD)，比较具有统计学意义(P＜0.05)，其中100ug/mL浓度能显著增加斑马鱼茜素红头骨染色面积(Area)及累积光密度总和(IOD)，比较具有统计学意义(P＜0.001)。
结论：补肾运脾方经过煎煮后的主要有效成分是绞股蓝皂苷、淫羊藿苷、甜菜碱、表儿茶素，其在方药中是稳定存在且量好的;其可能作用机制是通过刺激IL-6、BCL2调节P13K/AKT信号的来防治PMOP;且补肾运脾方能有效减低(脾肾两虚型)PMOP患者血清RANKL、ALP水平，提高血清LEP、OPG、Ca水平，明显改善(脾肾两虚型)PMOP患者中医症候积分;也对斑马鱼骨质疏松动物模型有较好的骨保护，且呈浓度梯度依赖型。