广西凡纳滨对虾白斑综合征病毒的检测及结构蛋白VP24和VP51的克隆与表达

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对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus, WSSV)是引起对虾病毒性疾病最主要的病毒之一,其传染性强,宿主分布广泛,可造成对虾养殖业巨大的经济损失。然而迄今为止,对该病毒尚没有有效的治疗措施,因此早期检测和诊断来筛选健康对虾群体、建立有效的预防监控系统、早切断传播途径成为现今防治该病的有效途径。结构蛋白是病毒结构与功能的体现者,是使动物机体发生各种毒性反应的主要成分。WSSV结构蛋白导入虾体,能提高虾体抵抗WSSV的能力。本研究用GB套式PCR法对广西沿海各地凡纳滨对虾进行WSSV检测,快速有效的了解广西沿海各对虾养殖场中凡纳滨对虾WSSV的携带情况,为凡纳滨对虾养殖提供理论参考。并成功克隆表达了蛋白VP24和VP51,为下一步蛋白纯化、抗体制备及重组蛋白性质和功能的研究,为研发一种全新的提高对虾特异性免疫水平的方法、制备一种亚疫苗制剂以达到预防WSSV感染的目的打下了基础。主要结果为:1、通过比较一步法PCR和套式PCR的检测结果,确定了GB套式PCR方法为检测WSSV的最优方法,并运用此方法对2013-2014年广西区内3个市下的8个县区(北海市市区、北海市铁山港区、北海市合浦县、钦州市市区、钦州市钦南区、防城港市防城区、防城港市港口区和防城港市东兴)共462份凡纳滨对虾样品(幼虾/成虾、虾苗/仔虾)进行WSSV感染情况调查。结果显示,WSSV总阳性数为83份,总阳性率17.97%。其中北海市市区对虾WSSV携带率最高,为43.59%。除北海市铁山港区没有检测到WSSV,其余县市均检测到阳性样品。幼虾/成虾的WSSV 阳性率29.41%,虾苗/仔虾的WSSV阳性率5.80%,明显低于幼虾/成虾的携带率。2013年虾的总阳性率为20.19%,2014年虾的总阳性率为13.10%,WSSV携带率有所下降。2、利用DNAStar软件对WSSV为阳性的7个县区的虾样品各选取1株进行核苷酸序列分析,结果发现7株广西分离株WSSV核苷酸同源性为96.8-99.4%;与Genbank上已知序列比对,发现广西分离株与印度株(JN165706.1)核苷酸同源性最高,达到了99.8-100%。构建基因遗传进化树,结果显示7株广西分离株同在一个大分支,种属的序列差异小,表明广西WSSV分离株没有明显的时间和地域差异,且与国外参考标准株亲缘关系也很近(96.8-100%)。3、PCR扩增得到vp24和vp51基因,并分别进行了克隆,获得重组质粒pMD18-T-vp24和pMD18-T-vp51,测序和双酶切检测显示克隆成功。构建重组表达载体pET-His-VP24和pET-His-VP51,并转化大肠杆菌BL21感受态细胞,加IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE电泳,结果表明有与预期大小23 kDa和29 kDa相符合的目的条带,目的蛋白初步确定成功表达。
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