ESC(embryonic stem cells，ESCs)是胚胎发育早期着床前囊胚内细胞团(innercell mass，ICM)在体外特定培养条件下建立的细胞系，具有在体外无限自我更新(self-renewal)和发育全能性(pluripotency)两大特性。研究发现ESC自我更新和定向分化的调控主要是通过细胞外信号分子与细胞内转录因子的共同作用而实现的。其中，转录因子Oct4、Nanog与Sox2对ESCs的命运起着决定性作用。　　 转录因子Oct4是ESCs多能性的主要监管因子，由Pou5fl基因编码。它特异地表达于小鼠胚胎发育过程中的全能和多能性细胞，在ESC、胚胎肿瘤细胞(embryonal carcinoma cells，ECCs)和胚胎生殖细胞(embryonic germ cells，EGCs)等未分化的体外培养细胞中也有高表达，而在分化的成体细胞中不表达。进一步的研究表明，Oct4蛋白水平必须维持在一定范围内才能维持ESCs的未分化状态。当Oct4蛋白水平降低至正常水平一半时，ESCs向滋养层细胞分化；而当其表达水平高于正常值两倍时，ESCs向原始内胚层和中胚层方向分化。因此，Oct4蛋白水平的调节对ESC全能性维持与分化都具有重要作用。但是，目前为止关于Oct4蛋白水平是如何被精确调控的分子机制尚不清楚。　　 为了揭示Oct4蛋白水平调控的机制，我们实验室通过蛋白质亲和层析方法来寻找与Oct4相互作用的蛋白，发现了一个与Oct4相互作用的新蛋白Wwp2。早期的研究证明Wwp2是一个含有HECT功能域的E3泛素连接酶，能特异性催化Oct4蛋白的泛素化修饰。已有的研究结果提示该泛素化修饰可能介导Oct4蛋白经26S蛋白酶体降解，起到调节Oct4蛋白水平的作用；另一方面，该修饰也可能参与了Oct4转录活性的调控。但是，Wwp2催化Oct4泛素化修饰的生理意义以及其作用的具体分子机制依旧未知。　　 为进一步地研究Wwp2泛素化修饰Oct4的分子机制以及Wwp2在ESC自我更新和分化中的作用，本课题开展了一系列研究，并得到以下研究结果：1)在体外反应体系中，Wwp2在催化Oct4发生多泛素化修饰并通过26S蛋白酶体发生降解的过程中，泛素分子之间的连接方式是通过第63位赖氨酸(Lys63)，而不是通过通常情况下的第48位赖氨酸(Lys48)，提示Lys63连接方式形成的泛素链也可能作为26S蛋白酶体的识别信号：2)运用特异性小干扰RNA下调小鼠多能性干细胞(ESCs，ECCs)中Wwp2的表达水平并不影响Oct4的蛋白水平与转录活性。但是，当使用低剂量反式维甲酸(retinoid acid，RA)定向诱导ECC系F9分化为原始内胚层细胞(primitive endoderm cells，PrE cells)时，小干扰RNA介导的Wwp2表达水平下调抑制了Oct4蛋白水平的下降，说明在原始内胚层分化过程中，Wwp2参与Oct4蛋白水平的调节，而在未分化状态时不具有此功能；3)进一步的分子机制研究揭示该现象主要可能与Wwp2呈剂量依赖性地调节其自我泛素连接酶活性的特异方式有关；4)Wwp2自我泛素化修饰的水平决定了其E3泛素连接酶活性，而且自我泛素化修饰是通过分子内反应的方式进行的。以上研究结果提示当细胞处于未分化状态时Wwp2高表达，蛋白分子之间形成二聚体从而干扰分子内的自我泛素化修饰，进而抑制连接酶活性；而在定向诱导分化为PrE细胞的过程中Wwp2蛋白表达水平逐渐下降，自我抑制现象解除，分子内反应的自我泛素化修饰程度增加，其E3泛素连接酶活性升高，进而提升Oct4泛素化修饰水平。泛素化修饰的Oct4经26S蛋白酶体降解，迅速下调Oct4的蛋白水平从而促进分化事件的进行。　　 本研究首次证明在定向诱导多能性F9细胞分化为PrE的过程中，Wwp2通过催化Oct4蛋白的泛素化修饰，然后经26S蛋白酶体降解，从而下调Oct4蛋白水平。揭示了Wwp2介导的翻译后修饰对于此分化事件的正常进行具有重要作用。同时，我们提出了一种呈剂量依赖方式调节E3泛素连接酶活性的新机制。这些研究结果从蛋白质翻译后修饰水平阐述了Oct4蛋白水平的调控机制，为全面揭示Oct4蛋白水平的精确调控及其生理意义提供了新的依据和线索。