木质纤维素降解酶的酶学特性表征及在产乙醇菌中的克隆表达

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本论文以木质纤维素降解为可发酵单糖的过程为背景,对木质纤维素降解酶的酶学特性表征及在产乙醇基因菌内的表达进行了研究。首先对木质纤维素预处理过程中所产生的三类降解产物进行了定性和定量分析,确定了七种降解产物作为代表性的酶水解与发酵抑制剂,包括三种有机酸产物甲酸、乙酸、乙酰丙酸;两种呋喃类产物糠醛、羟甲基糠醛;两种苯酚类产物香兰素、对羟基苯甲醛。对上述七种抑制物对工业纤维素酶SpezymeCP(GenencorInternational)的抑制作用在静态和充分混合的条件下进行了详细的表征。在对纤维素酶组分进行合理简化的前提下,对纤维素酶SpezymeCP在上述抑制物存在的条件下的酶反应动力学进行了实验测定,获得了SpezymeCP的各种表观酶动力学参数,包括表观米氏常数、最大反应速率和各类抑制物的表观抑制因子。同时测定乙醇作为抑制因子的表观动力学常数,并与木质纤维素降解产物的抑制效应进行了对比。基于上述表征结果,对上述七种木质纤维素抑制产物和乙醇对工业纤维素酶的抑制进行了详细分析。这一结果对定量理解木质纤维素预处理降解产物对纤维酶的抑制具有重要的意义。在此工作的基础之上,选择纤维素酶组分中最适于进行基因工程调控的纤维二糖酶在产乙醇基因菌ZymomonasmobilisZM4进行了表达,以使Z.mobilisZM4具备酶水解和乙醇发酵的双重功能。首先对不同物种来源的纤维二糖酶(β—葡萄糖苷酶)进行了筛选,挑选出了一个从BacilluspolymyxaAS1.794获得的高特异性水解纤维二糖的酶基因。将该基因克隆到本实验室构建的高效接合转化穿梭质粒pLOI193中,结合转化到Z.mobilisZM4中进行了过量表达,获得了高酶活的外源纤维二糖酶蛋白,为今后纤维素酶基因在产乙醇基因菌中的表达进行了有益探索。
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