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目的前列腺癌发展到晚期阶段常伴有骨骼的转移,严重影响着患者的生活质量。本研究通过体外细胞实验研究前列腺癌好发骨转移的原因和机制。通过研究骨髓间充质干细胞对于前列腺癌发生骨转移的作用机制,进一步寻找临床预防、治疗前列腺癌骨转移的新对策,从而采取相应的干预措施抑制前列腺癌的复发和转移,最终提高患者的生活质量。方法1.(1)提取小鼠骨髓,根据细胞贴壁生长方式不同,通过全骨髓培养的方法分离并纯化小鼠骨髓间充质干细胞,培养过程中观察细胞的形态学变化。(2)在体外通过诱导剂对间充质干细胞向脂肪细胞、成骨细胞的定向诱导,再行油红O染色、茜素红染色,对间充质干细胞进行鉴定。(3)收集培养间充质干细胞的上清液,标记记为间充质干细胞条件培养基(MSC-CM)。用MSC-CM培养对数生长期的前列腺癌细胞C42细胞1-5天,通过MTT的方法检测各细胞培养孔的吸光值,从而绘制出生长曲线。(4)细胞划痕实验,观察充质干细胞条件培养基处理C42细胞48个小时后细胞的爬片情况,使用Image J软件计算培养细胞的划痕面积。Transwell实验,在上室加入一定数量细胞,下室加入适量的充质干细胞条件培养基,培养24小时后,通过Giemsa染色观察转移至下室细胞的数量。2.(1)利用免疫磁珠细胞分选的方法(MACS)分选出CD133+前列腺癌干细胞,通过RT-PCR和Western Blot实验进一步验证细胞的干性。(2)用DMEM培养基培养CD133+C42细胞1-5天。通过MTT的方法检测各细胞培养孔的吸光值,绘制生长曲线。(3)用间充质干细胞条件培养基(MSC-CM)培养前列腺癌干细胞CD133+C42,分别在第2天及第4天后提取细胞的RNA及蛋白。通过RT-PCR和Western Blot实验观察前列腺癌干细胞表面标志物CD133、CD44的表达情况。结果1.(1)间充质干细胞在培养24小时后开始贴壁,可见短梭形、圆形以及多角形的细胞贴壁生长。3天后细胞突起长短不一。细胞生长第8天细胞密集生长。(2)间充质干细胞诱导形成的脂肪细胞脂质聚集,经过油红O染色,脂滴被染色橘红色,细胞核呈浅蓝色。经诱导形成的成骨细胞形态为多角形,体积增大。经过茜素红染色,产生深红色化合物。(3)生长曲线结果可见MSC-CM组的细胞增殖能力明显增加。(4)细胞划痕实验显示MSC-CM组细胞的划痕面积明显大于对照组。Transwell实验显示MSC-CM组细胞的数量明显大于对照组。2.(1)免疫磁珠细胞分选法(MACS)分选出CD133+C42,通过基因和蛋白水平对其检测,结果符合肿瘤干细胞的生物学特性。(2)MTT实验结果显示,MACS分选的前列腺癌干细胞CD133+C42在体外的增殖能力与未分选的前列腺癌细胞C42比较有明显增强。(3)对照组CD133、CD44表达逐渐减弱,而MSC-CM实验组能够稳定表达。结论1.骨髓间充质干细胞(MSCs)能够显著促进前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。2.骨髓间充质干细胞(MSCs)能够维持前列腺癌干细胞干性的稳定表达。