【摘 要】
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GPI化蛋白对酿酒酵母的生长来说是必需的.酵母中GPIT为-膜蛋白复合物,已知至少为四聚物:Gaalp(约68kDa)Gpi8p(约45kDa),Gpi16p(约65kDa)及Gpi17p(约61kDa).这四种成分对GPIT
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GPI化蛋白对酿酒酵母的生长来说是必需的.酵母中GPIT为-膜蛋白复合物,已知至少为四聚物:Gaalp(约68kDa)Gpi8p(约45kDa),Gpi16p(约65kDa)及Gpi17p(约61kDa).这四种成分对GPIT的功能都是必需的.目前,除了GPI8外,GAA1,GPI16和GPI17在已知功能的蛋白质中未发现其同系物,其功能尚不可知.该文为了阐明GPI17的功能,进行了一系列遗传学和生物化学实验,取得如下结果:1.对Gpi17p可能的三个保守区进行了PCR随机诱变,并最终获得显性负性等位基因:1)组建了Gpi17p突变体质粒库,其所含质粒数约为100000.从总共8000个菌落中进行筛选,得到强的显性负性等位基因25个,极强的3个(分别在第二个和第三个保守区).测序结果表明得到了点突变.2)生长曲线的测定表明,过表达Gpi17p对正常酵母细胞不致死,而只有显性负性突变体的过表达才会导致酵母细胞不能生长.3)FOA(5-氟-乳清酸)处理突变体细胞表明,得到的显性负性突变体不是细胞中铜抗性基因突变的产物,其确为GPI17突变引起.2.对获得的显性负性突变体进行了生物化学分析,以探明GPI17的功能: l)在突变的Gpi17p存在下,对细胞进行放射标记分析发现,细胞中有自由的GPI脂积累,同时细胞中没有新的脂类产生.这表面Gpi17p与GPI生物合成无关,而与蛋白质的GPI化有关. 2)测定过表达了突变Gpi17p细胞的存活曲线,并确定了培养介质中诱导物铜离子的适宜浓度. 3)蛋白质印迹分析表明,在突变Gpi17p存在下,有未成熟Gaslp的积累,表明存在蛋白质GPI化缺陷. 4)过表达突变Gpi17p,阻滞了Gaslp的易位,因此我们判断Gpi17很可能是具有蛋白质易位功能的GPIT成分. 5)在GPI8活性位点突变体中没有这种阻滞Gaslp易位的效应产生.
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