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单萜是一类自然界分布广泛的重要的萜类化合物,它们及其衍生物具有很高的应用价值,香叶醇是一个存在于芳香植物挥发性油中的非环状单萜醇,它可以应用于工业产品如化妆品等,同时还具有广泛的药理学作用。课题组前期通过向酿酒酵母引入香叶醇合成酶(Geraniol synthetase,GES)、超表达酵母内源甲羟戊酸途径(Mevalonic acid pathway,MVA pathway)关键基因和调控因子,表达融合蛋白、代谢的动态调控、香叶醇转化途径弱化等改造和调控策略,使香叶醇的产量达到了 1.69 g/L。该产量虽然为目前报道的利用酿酒酵母合成香叶醇的最高产量,但相比酿酒酵母合成倍半萜、双萜的产量,仍然有很大的提升空间。利用酿酒酵母细胞工厂合成单萜的产量较低,主要原因为:1.利用酿酒酵母合成香叶醇过程中关键前体香叶基焦磷酸供应量不足;2.酿酒酵母对香叶醇等单萜类物质耐受性差。本研究针对单萜合成中的第一个共性难题,以香叶醇为代表性产物,通过增加香叶醇合成前体香叶基焦磷酸(GPP)供应量来进一步提高单萜香叶醇的产量。酿酒酵母不含有专一性的香叶基焦磷酸合成酶,香叶基焦磷酸的合成通过法呢基焦磷酸合成酶催化合成,但香叶基焦磷酸只是作为中间产物。因此,我们首先对酿酒酵母内源的法呢基焦磷酸合成酶基因ERG20进行点突变改造,从而使得其编码的蛋白质更加倾向于催化合成香叶基焦磷酸,而催化合成法呢基焦磷酸(FPP)的活性降低。我们以鸟类的法呢基焦磷酸合成酶为模板,构建出了酿酒酵母法呢基焦磷酸合成酶Erg20p的结构模型,并选择了酶的活性中心距离底物异戊烯基焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate,IPP)及二甲基烯丙基焦磷酸(dimethyl allyl pyrophosphate,DMAPP)较近的三个关键氨基酸位点,分别是109位的精氨酸位点、168位的谷氨酰胺位点和201位的酪氨酸位点,对三个氨基酸位点进行点突变改造,最终当 168位由谷氨酰胺突变为精氨酸(R)时,提高最明显,达到了最高的2.77 mg/L,相比出发菌株,最终提高了53%,其次是201位氨基酸由酪氨酸突变为精氨酸(R)和组氨酸(H)时,产量相比于出发菌株提高了约 41%。其次,我们通过提高酿酒酵母细胞质中乙酰辅酶A的供应量来间接提高香叶基焦磷酸供应量。主要方法是向酿酒酵母细胞质中引入磷酸转酮酶途径(phosphoketolase pathway,PHK pathway),并进行途径优化提高乙酰辅酶A的供应。首先比较木酮糖-5-磷酸转酮酶xpk/乙酰激酶ack、木酮糖-5-磷酸转酮酶xpk/磷酸转乙酰酶pta途径以及、果糖-6-磷酸转酮酶fpk/磷酸转乙酰酶pta途径,确定了木酮糖-5-磷酸转酮酶xpk/乙酰激酶ack对香叶醇代谢的正向作用。在此基础上,通过强化酿酒酵母戊糖磷酸途径氧化阶段葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因ZWF1及非氧化阶段核酮糖-5-磷酸差向异构酶基因(RPE1)、核酮糖-5-磷酸异构酶基因(RKI1)、转酮酶基因(TKL1)和转醛酶基因(TAL1)的表达,进一步加强乙酰辅酶A的供应。最终携带有转酮酶基因xpkA及磷酸转乙酰酶基因pta并强化戊糖磷酸途径的菌株,香叶醇产量提高了 47%。