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研究背景和目的:2型糖尿病(T2D)是最常见的代谢性疾病之一,其主要特征是由于胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗而出现慢性高血糖。慢性创伤具有特征性的病理联系,不能通过有序和及时的修复来恢复结构和功能的完整性。在糖尿病患者中,每年有2%-3%的患者发生足部溃疡。糖尿病足是一种严重的T2D并发症,常导致疼痛、痛苦和生活质量低下。内皮克隆形成细胞(Endothelial colony-forming cells,ECFCs)被认为晚期内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs),在创伤修复中的作用受到广泛关注。ECFCs是一种来源于骨髓的原始细胞,在一定的条件下可诱导分化成为成熟的内皮细胞(endothelial cells,ECs)。该细胞不仅参与胚胎时期的血管生成,而且在人体出生后的血管新生、血管损伤的内皮修复以及功能维持中仍然有重要的作用。干/祖细胞对创面的修复机制可概括为:(1)分化为成熟内皮细胞;(2)旁分泌产生多种生物活性的细胞因子促进创面的血管新生及神经再生。为此,我们推测内皮克隆形成细胞通过旁分泌机制可促进糖尿病患者慢性创面的愈合以及破损处血管再生。本实验通过探讨ECFCs条件培养基(Conditioned medium,CM)对人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs)和人真皮成纤维细胞(Human Dermal Fibroblasts,HDFs)的作用功能,为ECFCs对于糖尿病患者创面修复作用提供新思路和理论支持。方法:1.ECFCs的提取、分离培养及鉴定1.1 ECFCs细胞提取及分离培养:采集健康志愿者脐带血,采用密度梯度离心法获得单个核细胞,将人纤维蛋白加入六孔细胞培养板中,置于37℃培养箱中孵育3h进行包被,接种到包被人纤维蛋白的细胞培养板中进行培养;1.2 ECFCs细胞鉴定:将培养的ECFCs细胞,采用流式细胞仪及免疫荧光法检测ECFCs细胞表面抗原,Matrigel成管实验对ECFCs细胞进行体外检测,共聚焦法检测ECFCs细胞对于Dil-acLDL和FITC-UEA-I的摄取结合能力。2.ECFCs-CM制备与细胞因子检测2.1细胞条件培养基ECFCs-CM的制备:对数生长期的ECFCs细胞于无血清的M199基础培养液中置于常氧和低氧条件下持续培养24h和48h,收集上清液,即为条件培养液(ECFCs-CM);2.2.细胞条件培养基(ECFCs-CM)细胞因子检测:采用抗体芯片及ELISA法检测ECFCs-CM细胞因子表达;3.ECFCs-CM对HUVECs和HDFs细胞的生物学作用3.1 CCK-8法检测ECFCs-CM对HUVECs和HDFs细胞增殖能力的影响;3.2细胞划痕法检测ECFCs-CM对HUVECs和HDFs迁移能力的影响;3.3 Transwell间接共培养法检测ECFCs对HUVECs和HDFs迁移能力的影响;3.4流式细胞仪检测ECFCs-CM对HUVECs和HDFs细胞周期的影响;3.5流式细胞仪检测ECFCs-CM对HUVECs和HDFs细胞凋亡的影响;4.丝素蛋白/海藻酸钠水凝胶的制备结果:1.ECFCs细胞提取及培养:ECFCs原代培养第4天,见少量呈纺锤形贴壁细胞,呈集落样生长集落中间可见圆形细胞,周边为梭形细胞,其结构与形状和血岛极其相似,ECFCs原代培养第8天,细胞集落开始接触融合;ECFCs原代培养第14天,细胞呈典型的“铺路石”样生长;2.ECFCs细胞的鉴定:流式细胞仪检测显示KDR、CD144(vWF)高表达,CD34部分表达,CD133、CD45低表达;Matrigel基质胶上形成管腔样结构,表现出典型的内皮细胞特征;3.抗体芯片检测显示,细胞条件培养基ECFCs-CM在常氧和低氧条件下多种细胞因子高表达,随时间表达谱稍有不同。在低氧条件且持续培养48h更有利于细胞培养液上清中细胞因子表达;ELISA法检测显示,EBM-2组的细胞上清液中的PDGF-BB、IL-8和EGF无表达,ECFCs-CM组的细胞上清液中的PDGF-BB、IL-8和EGF表达量较高;4.ECFCs-CM对HUVECs和HDFs细胞的作用:CCK-8法检测显示ECFCs-CM组的HUVECs和HDFs细胞增殖情况明显高于EBM-2组(P<0.05);细胞划痕法检测显示ECFCs-CM组的HUVECs和HDFs细胞培养至0h、6h和12h和24h细胞迁移覆盖率明显大于EBM-2组(P<0.05);Transwell间接共培养法检测显示ECFCs-CM共培养组的HUVECs和HDFs细胞数明显高于EBM-2组(P<0.05);流式细胞仪检测显示ECFCs-CM组的HUVECs和HDFs细胞处于G0/G1期细胞比例明显少于EBM-2组(P<0.05);ECFCs-CM组的HUVECs和HDFs细胞早晚期凋亡率明显降低。5.丝素蛋白/海藻酸钠水凝胶:SF/ALG复合水凝胶的孔径为50-120μm,FTIR光谱结果表明重要官能团的振动模式对比纯的ALG和SF,无明显差异;SF/ALG水凝胶孔隙率分析显示水凝胶孔隙率高,均一性良好;SF/ALG水凝胶溶胀度随着时间增加。结论:富含多种细胞因子的ECFCs-CM可促进HUVECs和HDFs细胞增殖、迁移和成管,减少HUVECs和HDFs细胞的凋亡,ECFCs通过旁分泌促进新生血管形成,为干/祖细胞旁分泌机制为基础的“无细胞”治疗策略促进糖尿病及难愈性创面修复可提供新思路。