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目的:TNF-α依赖炎症反应诱导肺组织炎症微环境在肺腺癌发生中起重要作用。我们最近研究发现TNF-α依赖炎症反应可能通过CXCR2调控肺泡上皮细胞（alveolar type II,AT-II）表达MHC-II,在炎症诱导肺腺癌发生中发挥作用。CXC受体2（CXCR2）属于G蛋白偶联受体家族,是7个CXCR家族中结合趋化因子最多的受体,其配体为CXCL1和CXCL2等炎症趋化因子,参与骨髓来源单核细胞的募集和分化。在小鼠前列腺癌接种瘤模型上,CXCR2调控单核细胞向M2型肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage,TAM）分化,促进肿瘤生长。目前,有关CXCR2及其下游信号通路在肺泡巨噬细胞浸润和免疫功能调控中作用的研究还是缺乏。肺泡巨噬细胞（Alveolar Macrophage,AM）根据来源不同可以分成骨髓单核细胞来源肺泡巨噬细胞（Monocyte-derived alveolar Macrophage,Mo M）和组织常驻肺泡巨噬细胞（Tissue-resident Alveolar Macrophage,TRAM）。肿瘤微环境可以诱导这两类巨噬细胞向TAM分化,参与肿瘤细胞生长和浸润。在肺腺癌发生前期炎症反应阶段,TNF-α介导炎症反应中是否通过CXCR2调控肺泡巨噬细胞的募集、分化、免疫功能改变而参与肺癌发生还不清楚。本研究采用了乌拉坦诱导的炎症介导的肺腺癌小鼠模型（inflammation-driven lung adenocarcinoma,IDLA）,探讨TNF-α介导的炎症反应对TRAMs或Mo Ms的CXCR2表达的影响。在此基础上,采用CXCR2基因敲除鼠和体外细胞培养,探讨CXCR2对肺泡巨噬细胞浸润和表型的影响,这对我们理解炎症微环境介导肺泡巨噬细胞浸润和分化参与肺癌发生具有重要意义。方法:1.构建IDLA模型:Balb/c小鼠腹腔注射乌拉坦8周,诱导肺部炎症反应;部分实验小鼠继续饲养4个月,诱导炎症介导的肺腺癌（IDLA）模型。采用Western blot方法、免疫组织化学方法检测炎症肺组织和肺腺癌组织中的CXCR2表达。免疫荧光染色检测CXCR2在炎症肺组织和肺腺癌组织中CD68+巨噬细胞上的表达。流式细胞术（FCM）检测肺组织中巨噬细胞的浸润及CXCR2表达。2.使用重组TNF-α阻断剂-益赛普（s TNFR:Fc,10mg/kg）,处理乌拉坦模型小鼠8周。免疫组织化学染色观察炎症肺组织及肺腺癌组织中CXCR2表达以及CD68+巨噬细胞浸润。免疫荧光染色观察CD68+巨噬细胞的CXCR2表达。FCM检测炎症肺组织及肺腺癌组织中巨噬细胞表达CXCR2的情况。3.体内敲除小鼠CXCR2基因,采用RT-PCR及FCM检测敲除CXCR2基因后肺组织中CXCR2表达情况。在此基础上检测肺腺癌肿瘤微环境中PD-L1、TNF-α、IL-6等细胞因子,观察肿瘤免疫微环境发生的变化。4.体外分离培养骨髓细胞,使用M-CSF诱导其分化为巨噬细胞,并分别使用不同刺激因子,给予CXCL1和CXCL-2及anti-CXCR2探讨其配体通过CXCR2诱导骨髓来源巨噬细胞浸润情况。结果:1.乌拉坦诱导的炎症相关肺腺癌（IDLA）中CXCR2表达增加在乌拉坦诱导的IDLA中,Western blot结果显示,肺腺癌组织中CXCR2在蛋白水平上表达明显增加。免疫组织化学结果显示,炎症和肺腺癌组织中CXCR2表达均明显增加;CXCR在肺腺癌中不仅表达于肿瘤细胞,还表达于在癌旁肺组织。2.IDLA中骨髓单核细胞来源肺泡巨噬细胞（Mo M）CXCR2表达上调免疫荧光检测定位结果显示CD68+巨噬细胞上表达CXCR2,相对于对照组,炎症组和肺腺癌组中CXCR2+CD68+巨噬细胞数量明显增多。流式细胞术（FCM）检测发现炎症组以及肺腺癌组中浸润的CD11bhighF4/80+Mo M中CXCR2表达上调;而在CD11blowF4/80+TRAM和MDSC中CXCR2表达较对照组没有变化。提示:骨髓来源肺泡巨噬细胞表达CXCR2可能参与肺腺癌的发生。3.TNF-α依赖的肺组织炎症反应调控Mo M中CXCR2表达采用TNF-α阻断剂处理乌拉坦诱导的小鼠8周,抑制肺组织炎症反应。免疫组化结果显示在肿瘤发生前期的炎症反应阶段,TNF-α阻断剂减少了肺组织中CXCR2+细胞数。免疫荧光结果显示,TNF-α阻断剂减少了炎症肺组织中CXCR2+CD68+细胞数。FCM结果显示,TNF-α阻断剂抑制炎症肺组织中CD11bhighF4/80+Mo M中CXCR2的表达。提示TNF-α依赖炎症反应调控炎症肺组织中Mo M的CXCR2的表达。4.抑制CXCR2减少Mo M浸润及表型分子表达给予乌拉坦诱导CXCR2-/-小鼠肺组织炎症反应,HE染色结果显示CXCR2-/-乌拉坦组小鼠的肺组织的炎症反应明显减轻;RT-PCR显示抑制CXCR2减少炎症肺组织中IL-6、TNF-α、CXCL2、MCP-1等炎症细胞因子的表达。FCM结果显示CXCR2敲除抑制小鼠肺组织中骨髓来源巨噬细胞浸润。免疫组织化学染色以及免疫荧光结果显示,CXCR2敲除抑制炎症肺组织CD68巨噬细胞中其PD-L1和TNF-α等表型分子表达。5.CXCR2介导骨髓来源巨噬细胞浸润细胞迁移实验结果显示,CXCL1和CXCL2对骨髓来源巨噬细胞的趋化作用较强,其中CXCL2的作用更明显;给予CXCR2拮抗剂SB225002能降低巨噬细胞的迁移能力,结果提示CXCR2介导骨髓来源巨噬细胞的浸润。分别给予M1和M2诱导因子诱导M0向M1和M2分化,免疫细胞荧光染色和RT-PCR结果显示,CXCR2在M2型巨噬细胞上的表达明显较强,提示CXCR2可能在巨噬细胞向M2型分化中发挥作用。结论:1.炎症介导肺腺癌发生小鼠模型中,骨髓来源肺泡巨噬细胞CXCR2表达增加。2.炎症介导肺腺癌发生中,TNF-α依赖的炎症反应调控骨髓来源肺泡巨噬细胞CXCR2表达。3.炎症介导肺腺癌发生中,CXCR2调控骨髓来源肺泡巨噬细胞向肺组织募集,影响巨噬细胞表型分子表达。