【摘 要】
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大蒜(Allium sativum)是无性繁殖的重要蔬菜作物,其体细胞胚发生分子机理的研究还比较薄弱.筛选稳定的内参基因有助于解析体细胞发生过程中基因和miRNA的差异表达.为筛选大蒜体细胞胚发生mRNA和miRNA qPCR检测体系中稳定的内参基因,本研究分别选取大蒜7个mRNA候选内参基因,包括肌动蛋白(actin,AsACTIN)、甘油醛三磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,AsGAPDH)、18S核糖体RNA(18S ribosomal R
【机 构】
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南京农业大学园艺学院/农业部华东地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室,南京210095
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大蒜(Allium sativum)是无性繁殖的重要蔬菜作物,其体细胞胚发生分子机理的研究还比较薄弱.筛选稳定的内参基因有助于解析体细胞发生过程中基因和miRNA的差异表达.为筛选大蒜体细胞胚发生mRNA和miRNA qPCR检测体系中稳定的内参基因,本研究分别选取大蒜7个mRNA候选内参基因,包括肌动蛋白(actin,AsACTIN)、甘油醛三磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,AsGAPDH)、18S核糖体RNA(18S ribosomal RNA,As18S rRNA)、多聚泛素酶(polyubiquitinase,AsUBQ)、α微管蛋白(α-tubulin,AsTUA)、转录因子LATE ELONGATED HYPOCOTYL(AsLHY)和Brassinosteroid resistant 1(AsBES1)及5个miRNA候选内参基因包括AsU6 snRNA、As5.8S rRNA、AsmiR159a-1、AsmiR168a和AsmiR168a-5p,采用qPCR技术分别检测各内参基因在不同基因型、不同外植体和不同2,4-D浓度作用下不同体细胞胚发育阶段的Ct值,利用Delta CT、BestKeeper、NormFinder和GeNorm 4种方法分析候选内参基因稳定值,并结合RefFinder综合评价候选内参基因的表达稳定性.结果表明:对于mRNA qPCR表达分析,AsACTIN是最适用于不同基因型的内参基因,AsBES1是不同外植体和不同2,4-D浓度处理下最稳定的内参基因,对所有样品进行综合评价,稳定性最好的内参基因是AsBES1.对于miRNA qPCR表达分析,不同基因型中最稳定的内参基因是AsmiR159a-1,AsmiR168a-5p是不同外植体中最稳定的内参基因,As5.8S rRNA是不同2,4-D浓度处理下最稳定的内参基因,综合评价所有样本,最理想的内参基因是AsU6 snRNA.为验证所筛选内参基因的稳定性,以7个mRNA候选内参基因和5个miRNA候选内参基因分别对大蒜体细胞胚发育过程中差异表达的植物激素相关转录因子髓细胞组织增生蛋白(myelocytomatosis protein 2,AsMYC2)和AsmiR167d-1进行qPCR分析.结果显示,以不同外植体中稳定性最好的AsBES1和AsmiR168a-5p为内参时,AsMYC2和AsmiR167d-1的表达趋势与测序数据保持一致,而以其他基因和miRNA为内参时,表达趋势有所不同,进一步证实了所筛选内参基因的可靠性.本研究可为准确检测大蒜体细胞胚发生过程中相关基因和miRNAs的表达提供支持,有助于大蒜体细胞胚发生机理的深入研究.
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