【摘 要】
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[目的]克隆表达嗜热古菌Archaeoglobus fulgidus(A.fulgidus)来源的RecJ核酸酶基因(ORF编号AF_0699,NCBI数据库基因登陆号为AF_RS03550),对该重组蛋白的核酸酶活性及酶学特征
【机 构】
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上海交通大学生命科学技术学院,微生物代谢国家重点实验室,上海200240
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[目的]克隆表达嗜热古菌Archaeoglobus fulgidus(A.fulgidus)来源的RecJ核酸酶基因(ORF编号AF_0699,NCBI数据库基因登陆号为AF_RS03550),对该重组蛋白的核酸酶活性及酶学特征进行鉴定和分析.[方法]将A.fulgidus RecJ(AfuRecJ)核酸酶在大肠杆菌中进行重组表达,经亲和层析纯化得到电泳纯蛋白;利用人工合成的带有末端荧光标记的寡核苷酸作为底物,体外反应后,利用8mol/L尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定AfuRecJ核酸酶的水解产物.[结果]AfuRecJ核酸酶具有单链DNA特异性的3'-5'外切核酸酶活性,酶活性依赖于二价金属离子Mn2+或Mg2+,且Mn2+存在条件下的催化效率明显优于Mg2+;其最适反应温度范围为55-65℃;高于200 mmol/L的NaCl会显著抑制AfuRecJ的核酸酶活性.AfuRecJ还具有单链RNA3'-5'外切酶活性,且活性高于单链DNA底物.单链核酸3'末端的磷酸基团对水解活性有一定抑制作用.AfuRecJ对单链核酸的长度有一定的选择性,可以有效水解长度≥4个核苷酸长度的单链RNA、≥12个核苷酸长度的单链DNA,而且对双链DNA中的3'单链DNA结构(3'突出单链尾巴与末端分叉结构)具有类似单链DNA的水解活性.[结论]本研究证实AfuRecJ是一种单链核酸特异性的3'-5'外切核酸酶,且相比单链DNA,单链RNA为优势底物,推测其在胞内可能参与RNA降解与DNA修复.
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