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摘要：探讨不同强度跑台运动对大鼠学习记忆能力及海马CA3区超微结构的影响。40只Wister大鼠随机被分为4组（对照组、低强度运动组、中强度运动组、高强度运动组，各10只），按各自强度运动60 d后，通过一次性被动回避反应实验，逐只测量其步入潜伏期的时间（STL）；后每组任选5只大鼠，取右侧海马CA3区按常规方法制作超薄切片，60K倍透射电镜观察并拍照，Motic Images Advanced 3.1软件测量相关突触界面结构。结果表明：低强度运动组大鼠，电击后24 h步入潜伏期的时间显著延长（P<0.05），海马CA3区突触后膜致密物质非常显著增厚（P<0.01）。突触界面呈现平直型、正向弯曲型和负向弯曲型三种，以平直型为主。由此可见，低等强度运动可增强记忆能力，并影响海马CA3区神经元突触结构发生可塑性变化，突触后膜致密物质厚度与记忆能力呈正相关。
关键词：学习记忆；突触；海马CA3区；超微结构；跑台运动
中图分类号：G804.7 文献标识码：A 文章编号：1007-3612（2012）03-0063-04
近年来，有关运动与学习记忆关系的研究备受学界关注。长期有规律的适宜运动可促进大鼠的空间学习记忆能力，研究表明，海马CA3区是学习记忆的关键脑区，其突触结构的可塑性变化与学习记忆能力关系密切。有关长时程增强效应（long-term po-tentiation，LTP）的研究资料证实：生活环境变化、行为训练、药物等因素均可引起学习记忆相关脑区神经元的突触修饰或新突触形成。在健身运动日益科学化的今天，如何科学益智地运动，是人们十分关注的问题。不同强度的跑台运动对学习记忆能力到底有何影响？与学习记忆关键脑区有何关联？这些问题的相关性研究资料还很少。本文旨在通过不同强度的跑台运动，探讨其对学习记忆能力及海马区CA3神经元突触结构的影响，为揭示运动与脑科学中易化学习记忆的神经机制研究积累有价值的资料。
1、材料和方法
1.1 动物分组及喂养环境 雄性Wister成年大鼠（购自兰州大学实验动物中心）40只，体重168～220g，被随机分为四组：对照组（C，10只）、低强度运动组（LS，10只）、中强度运动组（MS，10只）、高强度运动组（HS，10只）。所有大鼠在塑料代谢笼（加不锈钢网状盖）分笼喂养，内置消毒木屑。普通饲料喂养，饮自来水。动物室温度在20～23℃，相对湿度在40～60%，自然光照，饲养室、用具每周用紫外灯消毒灭菌一次。
1.2 跑台训练 C组大鼠不运动，笼内自由生活取食。运动组大鼠在跑台（DSPT-202，中国杭州钱江科工贸公司制造）上熟悉运动3d后，LS组大鼠按15 m/min速度运动，每日30 rain；MS组大鼠按25 m/min速度运动，每日30 min；HS组大鼠以25 m/min速度开始运动，每日20 min，后每日以1 m/min增加跑台速度，直至30 m/min终止。各组大鼠每6日休息一日，共计运动60 d。
1.3 回避反应箱制作及STL测试 用木板自制回避反应箱（80×20×45 cm），箱底装有间隔1 cm的细铁条，反应箱被一有孔隔板分为两半部，动物可自由穿行，一侧与电源相连，另一侧不连接电源，为安全区。第60 d，先使所有大鼠熟悉一次性被动回避反应箱环境，后置于反应箱内自由穿行，当到达连接电源的一侧时，用50 v交流电连续刺激5 s。电击后24 h，将每只大鼠置于安全区，用秒表逐只记录其步人潜伏期的时间（step-through latency，STL）。记录所得数据并统计分析。
1.4 动物取材及电镜样品制备 测定完全部动物步入潜伏期的时间后，在深麻醉下（0.4%戊巴比妥钠腹腔注射），用2%多聚甲醛和2.5%戊二醛磷酸缓冲液（pH7.4）经左心室→主动脉灌注固定，即刻剥取整脑后置于上述固定液中浸泡3～4 h，再移入20%蔗糖磷酸缓冲液中4℃冰箱过夜。
每组任选5只大鼠整脑，参照鼠脑图谱切取右侧海马CA3区，切下1 mm3组织2块，锇酸固定、漂洗、常规脱水，Epon812包埋，先制成半薄切片，1%甲苯胺蓝染色，光镜定位后，再用LKM超薄切片机制成超薄切片，每块切2片，经枸橼酸铅及醋酸铀染色，共计制成80张铜网，用JEM-1230EX型透射电镜在60K倍下观察并用其CCD（数码照相机）拍照，每张铜网拍片两张，共计拍片160张。
1.5 突触界面结构测量法 将每张60 K倍电镜照片导入Mofic Images Advanced3.1软件中，参照Jones等方法，测量突触界面曲率，即突触界面弧长（a）与弦长（b）之比。平直型界面，弧长等于弦长、曲率为1（图1）。
参照Culdner的方法，用Motic IITlflges Advanced3.1软件测量突触活性区长度和突触后膜致密物质厚度（PSl3），突触间隙宽度用多点平均法测量（图2）。
2、结果
2.1 实验后大鼠STL测定
实验组大鼠运动60 d后，测定了实验组和对照组中每只大鼠电击后24 h的步人潜伏期的时间，其结果见表1。表1结果显示：实验各组均与对照组比较，LS组动物的步人潜伏期时间有显著性差异（P<0.05），说明低强度运动有巩固和提高大鼠学习记忆能力的作用。
2.2 电镜观察结果 电镜下观察，所见各组动物海马CA3区的GrayI型突触，符合兴奋性突触的形态特征（图3）。突触界面活性区长度、突触后膜致密物质厚度、突触间隙宽度及曲率的统计结果见表2。
从表2结果我们可以看出，与对照组相比，低强度运动组（LS）大鼠海马CA3区突触后膜致密物质极显著地增厚（图4）。而中强度运动组（MS，图5）和高强度运动组（HS，图6）没有出现显著变化。各运动组之间，所有参数均无统计学差异。这提示低强度运动有较强的激发突触活性区的作用，可能参与突触部位神经递质或其它相关功能物质的合成或释放过程。另外，60K倍电镜下，海马CA3区突触界面呈现不同的类型，具有平直型（突触前膜与突触后膜近似平行，图7）和弯曲型两种。弯曲型又有可分为两种形式：突触后膜向前膜一侧弯曲的，为正向弯曲型；突触前膜向突触后膜一侧弯曲的称负向弯曲型，各突触界面弯曲类型观察统计结果见表3。 由表3结果可见：不同强度跑台运动对大鼠海马CA3区神经元的突触界面类型，没有明显影响。
3、讨论
本实验应用JEM-1230EX型透射电镜在60K倍下观察并用其OCD拍照，将每张照片导人MoticImages Advanced 3.1软件中，用其工具测量了突触间隙宽度、突触后膜致密物质厚度、活性区长度、弧长和弦长、并由此计算了曲率。这种将学习记忆能力与海马CA3区突触结构可塑性变化结合在Motic ImagesAdvanced 3.1软件中，以数码方式处理并呈现，较以往手工测量有较大优点。它可以减少测量误差、节省测量时间，减少主观因素影响，使结果更加客观而可信。
Ader等（1972）曾报道，用一次性被动回避反应箱观测大鼠在不同刺激强度、不同电击时间等因素作用下的记忆保持能力，为后来一次性被动回避反应箱在学习记忆中的广泛应用开创了先河。而后王光建（1987）实验了小鼠一次性被动回避反应参数的影响因素，章子贵（1995）应用此模型测试了小鼠记忆保持能力与海马CA3区突触界面结构的相关性。本实验所用的一次性被动回避反应箱以王光建实验设计为模版，将长、宽、高适度放大自行改建而成，测设方法与章子贵实验较接近，但比其手段更先进和科学，故结果更加可靠、可信。
1949年Hebb在其专著中阐述的“突触修饰”理论，是多半个世纪以来学者们研究学习记忆神经机制的重要理论依据。本实验结果表明：低强度跑台运动对成年大鼠电击后24 h所测STL和海马CA3区神经元突触后膜致密物质厚度（PSI），图8）有显著影响，而中、高强度运动都没有造成显著影响。现已发现：海马是学习记忆的关键脑区，该区神经元突触后膜致密物质增厚，是其兴奋过程的重要表现形式，也是学习记忆能力巩固与加强的形态结构基础。据此可以认为，不同强度运动、学习记忆能力和海马CA3区神经元突触界面结构的可塑性变化三者之间存在着紧密的相关关系。
研究表明：运动能促进人的认知功能、个性和学习记忆能力发展。运动有助于动物海马等脑区神经元增殖、存活和分化，并促进长时程增强（LTP）效应，可提高实验动物的空间记忆和被动逃避记忆能力。国内张辉等的研究也发现：使血管性痴呆大鼠进行转轮、平衡木、网屏等运动训练，可提高它们的空间学习和记忆的能力，易化海马LTP的形成。这些实验结果与本实验结果基本一致。由此可以得出初步结论：低强度有氧运动可以有效促进大鼠学习记忆能力提高。
在突触界面结构上，PSD是最容易改变的参数。相关研究表明，PSD含有多种蛋白质（微管蛋白、肌动蛋白、神经丝蛋白等）和酶，有诸多因素影响其变化。持续光照、连续补Zn、电刺激、脑室内药物注射等均可使相关脑区的PSD增厚或变薄，PSD增厚是突触功能增强的结构基础。我们据此认为，这些蛋白质分子构型的改变，表现为致密物质厚度的增加或减薄。低强度跑台运动提高大鼠学习记忆能力的机制与海马NMDA（N-甲基-D天门冬氨酸）受体亚单位NRI、NR2B以及BDNF（脑源性神经营养因子）基因表达的增加密切相关。谷氨酸是中枢神经系统中最主要的兴奋性递质，NMDA受体是非常重要的突触后成分，其在海马等脑区表达最高，它被激活可介导快速的兴奋性突触传递而形成突触结构和功能的可塑性。具体机制可能是：低强度运动首先引起外周胰岛素样生长因子（IGF-Ⅰ）水平增加，其透过血脑屏障使中枢IGF-Ⅰ也相应增加，从而促进c-fos和BDNF的表达。而BDNF能磷酸化实验动物海马突触后NM.DA受体的NRl和NR2单元，形成NRl一NR2复合体，使其处于激活状态。NMDA受体不仅控制Na+、K+通道，而且还控制着Ca2+通道，当NMDA受体被激活时，可引起Ca2+通透性增加，使大量的Ca2+进人胞内，导致胞内游离[Ca2+]升高，进而激活钙调蛋白激酶Ⅱ（CAVIKⅡ），促使CaMKⅡ与NMDA受体亚基NR2B的细胞内C末端结合，这种结合又可激活PKA及Ras/MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）通路，进一步发挥其第二信使的功能，激发LTP产生并引起一系列下游级联反应而合成相关蛋白质，从而造成突触结构和功能的可塑性，易化学习记忆能力。而中、高强度运动不能引起上述系列反应，表现为PSD无明显变化与其学习记忆能力无显著性差异相关联。
4、结论
从本实验结果来看，低强度有氧跑台运动可增强大鼠学习记忆能力，并影响其海马CA3区神经元突触结构发生可塑性变化，突触后膜致密物质厚度与记忆能力呈正相关。而中、高强度有氧跑台运动没有使大鼠出现这些变化，这提示我们，低强度有氧运动可易化学习记忆能力。
关键词：学习记忆；突触；海马CA3区；超微结构；跑台运动
中图分类号：G804.7 文献标识码：A 文章编号：1007-3612（2012）03-0063-04
近年来，有关运动与学习记忆关系的研究备受学界关注。长期有规律的适宜运动可促进大鼠的空间学习记忆能力，研究表明，海马CA3区是学习记忆的关键脑区，其突触结构的可塑性变化与学习记忆能力关系密切。有关长时程增强效应（long-term po-tentiation，LTP）的研究资料证实：生活环境变化、行为训练、药物等因素均可引起学习记忆相关脑区神经元的突触修饰或新突触形成。在健身运动日益科学化的今天，如何科学益智地运动，是人们十分关注的问题。不同强度的跑台运动对学习记忆能力到底有何影响？与学习记忆关键脑区有何关联？这些问题的相关性研究资料还很少。本文旨在通过不同强度的跑台运动，探讨其对学习记忆能力及海马区CA3神经元突触结构的影响，为揭示运动与脑科学中易化学习记忆的神经机制研究积累有价值的资料。
1、材料和方法
1.1 动物分组及喂养环境 雄性Wister成年大鼠（购自兰州大学实验动物中心）40只，体重168～220g，被随机分为四组：对照组（C，10只）、低强度运动组（LS，10只）、中强度运动组（MS，10只）、高强度运动组（HS，10只）。所有大鼠在塑料代谢笼（加不锈钢网状盖）分笼喂养，内置消毒木屑。普通饲料喂养，饮自来水。动物室温度在20～23℃，相对湿度在40～60%，自然光照，饲养室、用具每周用紫外灯消毒灭菌一次。
1.2 跑台训练 C组大鼠不运动，笼内自由生活取食。运动组大鼠在跑台（DSPT-202，中国杭州钱江科工贸公司制造）上熟悉运动3d后，LS组大鼠按15 m/min速度运动，每日30 rain；MS组大鼠按25 m/min速度运动，每日30 min；HS组大鼠以25 m/min速度开始运动，每日20 min，后每日以1 m/min增加跑台速度，直至30 m/min终止。各组大鼠每6日休息一日，共计运动60 d。
1.3 回避反应箱制作及STL测试 用木板自制回避反应箱（80×20×45 cm），箱底装有间隔1 cm的细铁条，反应箱被一有孔隔板分为两半部，动物可自由穿行，一侧与电源相连，另一侧不连接电源，为安全区。第60 d，先使所有大鼠熟悉一次性被动回避反应箱环境，后置于反应箱内自由穿行，当到达连接电源的一侧时，用50 v交流电连续刺激5 s。电击后24 h，将每只大鼠置于安全区，用秒表逐只记录其步人潜伏期的时间（step-through latency，STL）。记录所得数据并统计分析。
1.4 动物取材及电镜样品制备 测定完全部动物步入潜伏期的时间后，在深麻醉下（0.4%戊巴比妥钠腹腔注射），用2%多聚甲醛和2.5%戊二醛磷酸缓冲液（pH7.4）经左心室→主动脉灌注固定，即刻剥取整脑后置于上述固定液中浸泡3～4 h，再移入20%蔗糖磷酸缓冲液中4℃冰箱过夜。
每组任选5只大鼠整脑，参照鼠脑图谱切取右侧海马CA3区，切下1 mm3组织2块，锇酸固定、漂洗、常规脱水，Epon812包埋，先制成半薄切片，1%甲苯胺蓝染色，光镜定位后，再用LKM超薄切片机制成超薄切片，每块切2片，经枸橼酸铅及醋酸铀染色，共计制成80张铜网，用JEM-1230EX型透射电镜在60K倍下观察并用其CCD（数码照相机）拍照，每张铜网拍片两张，共计拍片160张。
1.5 突触界面结构测量法 将每张60 K倍电镜照片导入Mofic Images Advanced3.1软件中，参照Jones等方法，测量突触界面曲率，即突触界面弧长（a）与弦长（b）之比。平直型界面，弧长等于弦长、曲率为1（图1）。
参照Culdner的方法，用Motic IITlflges Advanced3.1软件测量突触活性区长度和突触后膜致密物质厚度（PSl3），突触间隙宽度用多点平均法测量（图2）。
2、结果
2.1 实验后大鼠STL测定
实验组大鼠运动60 d后，测定了实验组和对照组中每只大鼠电击后24 h的步人潜伏期的时间，其结果见表1。表1结果显示：实验各组均与对照组比较，LS组动物的步人潜伏期时间有显著性差异（P<0.05），说明低强度运动有巩固和提高大鼠学习记忆能力的作用。
2.2 电镜观察结果 电镜下观察，所见各组动物海马CA3区的GrayI型突触，符合兴奋性突触的形态特征（图3）。突触界面活性区长度、突触后膜致密物质厚度、突触间隙宽度及曲率的统计结果见表2。
从表2结果我们可以看出，与对照组相比，低强度运动组（LS）大鼠海马CA3区突触后膜致密物质极显著地增厚（图4）。而中强度运动组（MS，图5）和高强度运动组（HS，图6）没有出现显著变化。各运动组之间，所有参数均无统计学差异。这提示低强度运动有较强的激发突触活性区的作用，可能参与突触部位神经递质或其它相关功能物质的合成或释放过程。另外，60K倍电镜下，海马CA3区突触界面呈现不同的类型，具有平直型（突触前膜与突触后膜近似平行，图7）和弯曲型两种。弯曲型又有可分为两种形式：突触后膜向前膜一侧弯曲的，为正向弯曲型；突触前膜向突触后膜一侧弯曲的称负向弯曲型，各突触界面弯曲类型观察统计结果见表3。 由表3结果可见：不同强度跑台运动对大鼠海马CA3区神经元的突触界面类型，没有明显影响。
3、讨论
本实验应用JEM-1230EX型透射电镜在60K倍下观察并用其OCD拍照，将每张照片导人MoticImages Advanced 3.1软件中，用其工具测量了突触间隙宽度、突触后膜致密物质厚度、活性区长度、弧长和弦长、并由此计算了曲率。这种将学习记忆能力与海马CA3区突触结构可塑性变化结合在Motic ImagesAdvanced 3.1软件中，以数码方式处理并呈现，较以往手工测量有较大优点。它可以减少测量误差、节省测量时间，减少主观因素影响，使结果更加客观而可信。
Ader等（1972）曾报道，用一次性被动回避反应箱观测大鼠在不同刺激强度、不同电击时间等因素作用下的记忆保持能力，为后来一次性被动回避反应箱在学习记忆中的广泛应用开创了先河。而后王光建（1987）实验了小鼠一次性被动回避反应参数的影响因素，章子贵（1995）应用此模型测试了小鼠记忆保持能力与海马CA3区突触界面结构的相关性。本实验所用的一次性被动回避反应箱以王光建实验设计为模版，将长、宽、高适度放大自行改建而成，测设方法与章子贵实验较接近，但比其手段更先进和科学，故结果更加可靠、可信。
1949年Hebb在其专著中阐述的“突触修饰”理论，是多半个世纪以来学者们研究学习记忆神经机制的重要理论依据。本实验结果表明：低强度跑台运动对成年大鼠电击后24 h所测STL和海马CA3区神经元突触后膜致密物质厚度（PSI），图8）有显著影响，而中、高强度运动都没有造成显著影响。现已发现：海马是学习记忆的关键脑区，该区神经元突触后膜致密物质增厚，是其兴奋过程的重要表现形式，也是学习记忆能力巩固与加强的形态结构基础。据此可以认为，不同强度运动、学习记忆能力和海马CA3区神经元突触界面结构的可塑性变化三者之间存在着紧密的相关关系。
研究表明：运动能促进人的认知功能、个性和学习记忆能力发展。运动有助于动物海马等脑区神经元增殖、存活和分化，并促进长时程增强（LTP）效应，可提高实验动物的空间记忆和被动逃避记忆能力。国内张辉等的研究也发现：使血管性痴呆大鼠进行转轮、平衡木、网屏等运动训练，可提高它们的空间学习和记忆的能力，易化海马LTP的形成。这些实验结果与本实验结果基本一致。由此可以得出初步结论：低强度有氧运动可以有效促进大鼠学习记忆能力提高。
在突触界面结构上，PSD是最容易改变的参数。相关研究表明，PSD含有多种蛋白质（微管蛋白、肌动蛋白、神经丝蛋白等）和酶，有诸多因素影响其变化。持续光照、连续补Zn、电刺激、脑室内药物注射等均可使相关脑区的PSD增厚或变薄，PSD增厚是突触功能增强的结构基础。我们据此认为，这些蛋白质分子构型的改变，表现为致密物质厚度的增加或减薄。低强度跑台运动提高大鼠学习记忆能力的机制与海马NMDA（N-甲基-D天门冬氨酸）受体亚单位NRI、NR2B以及BDNF（脑源性神经营养因子）基因表达的增加密切相关。谷氨酸是中枢神经系统中最主要的兴奋性递质，NMDA受体是非常重要的突触后成分，其在海马等脑区表达最高，它被激活可介导快速的兴奋性突触传递而形成突触结构和功能的可塑性。具体机制可能是：低强度运动首先引起外周胰岛素样生长因子（IGF-Ⅰ）水平增加，其透过血脑屏障使中枢IGF-Ⅰ也相应增加，从而促进c-fos和BDNF的表达。而BDNF能磷酸化实验动物海马突触后NM.DA受体的NRl和NR2单元，形成NRl一NR2复合体，使其处于激活状态。NMDA受体不仅控制Na+、K+通道，而且还控制着Ca2+通道，当NMDA受体被激活时，可引起Ca2+通透性增加，使大量的Ca2+进人胞内，导致胞内游离[Ca2+]升高，进而激活钙调蛋白激酶Ⅱ（CAVIKⅡ），促使CaMKⅡ与NMDA受体亚基NR2B的细胞内C末端结合，这种结合又可激活PKA及Ras/MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）通路，进一步发挥其第二信使的功能，激发LTP产生并引起一系列下游级联反应而合成相关蛋白质，从而造成突触结构和功能的可塑性，易化学习记忆能力。而中、高强度运动不能引起上述系列反应，表现为PSD无明显变化与其学习记忆能力无显著性差异相关联。
4、结论
从本实验结果来看，低强度有氧跑台运动可增强大鼠学习记忆能力，并影响其海马CA3区神经元突触结构发生可塑性变化，突触后膜致密物质厚度与记忆能力呈正相关。而中、高强度有氧跑台运动没有使大鼠出现这些变化，这提示我们，低强度有氧运动可易化学习记忆能力。