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摘要：采用RAPD分子标记，对彩色马蹄莲Parfait（Pr）及其秋水仙素诱导的四倍体（Pr-d）和20、40、60 Gy 60Co γ射线辐射诱变后代（Pr-1、Pr-2和Pr-4）分子水平的变异进行研究。从40个寡聚核苷酸引物种筛选出14个合适的引物进行扩增，5个样品共扩增出位点90个，平均每个引物扩增出6.29个位点；其中，多态性位点39个，多态性位点的比率为43.33%。此外，还观察到的等位基因数（na）为1.4021个，有效等位基因数（ne）为1.2965个，Neis基因多样性（h）为0.166 6，Shannons多样性指数（I）为0.242 1。可见，多倍体诱导和辐射诱变使彩色马蹄莲Parfait在分子水平产生了一定的变异，丰富了彩色马蹄莲遗传多样性。通过聚类分析将5个样品可分为2支，其中Pr、Pr-2和Pr-d聚为一支，Pr-1和Pr-4聚为一支。
关键词：多倍体；诱导；彩色马蹄莲；RAPD；遗传相似性；聚类分析；抗病育种；分子生物学
中图分类号： S335.21；S682.2 64.03 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2015）03-0142-02
彩色马蹄莲（Zantedeschia hybrida）为天南星科（Araceae）马蹄莲属（Zantedeschia）多年生草本植物，原產于南非[1]。自20世纪80年代末引入我国以来，彩色马蹄莲以其花色绚烂、花形高雅、观花期长而深受消费者的喜爱，因此被称为21世纪的“明星花卉”。彩色马蹄莲在栽培过程中最严重的病害是软腐病[2]，其在引种到我国长江中下游地区后受高温高湿的影响，软腐病病害问题更加突出，培育抗软腐病的彩色马蹄莲品种是解决这一问题的有效途径。但彩色马蹄莲所有品种对该病的抗性均比较弱；而且目前彩色马蹄莲新品种培育方式以杂交育种为主。很显然，这种育种方式很难培育出抗病的彩色马蹄莲品种。所以，研究人员探索采用物理或化学诱变的方式提高彩色马蹄莲的抗病性，从而培育抗病的彩色马蹄莲品种。本试验采用RAPD分子标记技术对彩色马蹄莲品种Parfait（编号为Pr）及其秋水仙素诱导的四倍体（编号为Pr-d）和20、40、60 Gy 60Co γ射线辐射诱变后代（分别编号为Pr-1、Pr-2和Pr-4）分子水平的变异和差异进行研究，为彩色马蹄莲抗病新品种的培育提供分子生物学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
本试验材料为2002年引种自荷兰的彩色马蹄莲品种Parfait，其佛焰苞粉红色（上红下白），叶片盾剑形，上有斑点，引种后在本地的适应性良好。除Parfait外，还有经20、40、60 Gy 60Co γ射线辐射处理的Parfait组培苗及秋水仙素诱导的四倍体Parfait组培苗共5个样品，每个样品组培苗继代次数均在10次以上，随机选取10株，每株分别取样，然后混合，用于提取DNA。
1.2 试验方法
1.2.1 模板DNA的制备与检测
采用北京百泰克生物技术有限公司出品的新型快速植物基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）提取彩色马蹄莲叶片DNA；采用贝克曼库尔特公司生产的DU800紫外/可见光分光光度计测定DNA纯度和含量，并对浓度较高的样品进行稀释，-20 ℃储存，备用。
1.2.2 RAPD-PCR 体系及引物筛选
以提取的彩色马蹄莲Parfait DNA为模板，参照陆波等的方法[3]，对北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司和生工生物工程（上海）股份有限公司合成的40条引物进行多态性筛选，选择条带多态性强、扩增位点多的引物对供试的彩色马蹄莲品种及Parfait辐射诱变处理和多倍体进行RAPD扩增。
1.3 数据分析
每个样品的扩增条带按有（记为1）、无（记为0）进行记录，在Excel表格上生成数据矩阵。计算扩增条带的多态率，用POPGen32软件[4]进行聚类分析。
2 结果与分析
2.1 彩色马蹄莲样品RAPD分子标记结果
利用筛选出来的引物，对彩色马蹄莲 Parfait、Parfait四倍体和辐射诱变后代进行RAPD-PCR，最终筛选出具有特异性条带的引物14个，共获得90个位点，平均每个引物扩增出6.43个位点；其中，多态性位点39个，多态性位点比例为4333%。引物RAPD-47和RAPD-66扩增出的位点最多，均为9个；RAPD-73扩增出的位点最少，仅4个。引物RAPD-66扩增出的多态位点比例最高，为88.89%；有半数引物扩增出的位点全部为共有位点，多态性位点比例为0（表1）。由引物66扩增的RAPD图谱（图1）可见，多倍体诱导和 60Co γ射线辐射使Parfait扩增片段减少，从而表现出多态性。
2.2 彩色马蹄莲Parfait 四倍体及其辐射诱变后代分子水平变异分析
5个陈彩色马蹄莲样品观察到的等位基因数（na）为1402 1个，有效等位基因数（ne）为1.296 5个，Neis基因多样性（h）为0.1666，Shannons多样性指数（I）为0.242 1。
2.3 彩色马蹄莲Parfait多倍体及其辐射诱变与其他品种的亲缘关系的聚类分析
由表2可知，40 Gy 60Co γ射线辐射诱变后代（Pr-2）与四倍体Parfait（Pr-D）遗传相似系数最大，为0.886 6；Parfait与其60 Gy 60Co γ射线辐射诱变后代（Pr-4）间遗传相似系数最小，为0.701 0；所有样品遗传相似系数的平均值0.791 8。
由图2可以看出，5个样品可分为2类，Pr、Pr-2和 Pr-D 聚为一支；Pr-2和Pr-4聚为一支。
3 结论与讨论 自20世纪80年代以来，我国共引入彩色马蹄莲品种40多个。此后，我国研究人员对彩色马蹄莲的快繁技术[5-6]、栽培措施[7-9]、花期调控[10-12]和抗病生理[13-14]等进行了广泛的研究，但关于彩色马蹄莲的分子生物学方面的研究仅有零星的报道[15-17]。在彩色马蹄莲品种间的亲缘关系和多样性分析方面，迄今只有张永春等利用ISSR对10个彩色马蹄莲品种进行鉴定[17]。本试验利用RAPD技术研究多倍体诱导和 60Co γ射线辐射对彩色马蹄莲品种Parfait分子水平遗传变异的影响，结果表明，Parfait、Parfait四倍体及其 60Co γ射线辐射处理多态性条带比率最高为88.89%，平均值为 43.33%，多态性主要表现为多倍体诱导和 60Co γ射线辐射使Parfait的扩增片段减少，但这种多态性远远低于彩色马蹄莲品种间多态性[17]；但与陈臻等基于ISSR标记 12C6 重离子辐射下的彩色马蹄莲多态性十分接近[18]。各样品间的遗传相似系数最大为0.886 6，低于彩色马蹄莲品种间的遗传相似系数[17]，说明多倍体诱导和 60Co γ射线辐射处理致使Parfait分子水平的变异已经达到了品种水平。在对其变异性状及其稳定性进行观测的基础上，培育出彩色马蹄莲新品种是完全可能的。同时，各样品多态性条带比率最高达88.89%，表明通过建立彩色马蹄莲品种分子指纹图谱鉴别彩色马蹄莲品种以解决市场上彩色马蹄莲品种混乱的问题是可行的。
参考文献：
[1]中国植物志编辑委员会. 中国植物志：第13卷第2分册[M]. 北京：科学出版社，1990.
[2]谷春艳，范加勤，杨 雪，等. 彩色马蹄莲细菌性软腐病菌的鉴定及其群体感应淬灭的研究[J]. 南京农业大学学报，2009，32（3）：71-77.
[3]陆 波，郑玉红，彭 峰，等. 均匀设计法优化彩色马蹄莲品种的RAPD-PCR反应体系[J]. 北方园艺，2012（11）：123-126.
[4]Yeh F C，Yang R C，Boyle T. POPGENE version 1.31：microsoft window-based freeware for population genetic analysis[CP /CD]. Edmonton：University of Alberta，1999.
[5]林 荣，王秀琴. 马蹄莲的组织培养和快速繁殖[J]. 广西植物，1989，9（2）：97-102.
[6]范加勤，張雯雯，张 娜，等. 几个彩色马蹄莲品种的离体培养与快速繁殖[J]. 南京农业大学学报，2005，28（2）：28-31.
[7]张军云，杨向红，李 恒，等. 彩色马蹄莲试管苗移载育苗技术研究[J]. 北方园艺，2009（4）：202-204.
[8]徐 琼，彭志云. 栽培基质对彩色马蹄莲试管移栽成苗及成球效果的研究[J]. 农业网络信息，2007（5）：215-216，229.
[9]彭 峰，陈嫣嫣，郝日明，等. 彩色马蹄莲组培苗壮苗生根及移栽措施研究[J]. 江苏农业科学，2008（1）：126-128.
[10]黄作喜，吴学尉，段辉国，等. 彩色马蹄莲种球采收处理技术[J]. 内江师范学院学报，2004，19（2）：35-37.
[11]钱妙芬. 马蹄莲花期调控指标探析[J]. 中国生态农业学报，2003，11（4）：32-33.
[12]张璐萍，唐开学，张丽芳. 温度、赤霉素、光照对彩色马蹄莲的花期调控[J]. 种子，2005，24（10）：36-37.
[13]徐 琼，彭志云，徐秉良，等. 栽培措施对彩色马蹄莲细菌性软腐病发生的影响[J]. 植物保护，2008，34（2）：87-89.
[14]王 敏，姬广海，修建华，等. 云南省马蹄莲细菌性软腐病原鉴定[J]. 西南大学学报：自然科学版，2007，29（8）：79-82.
[15]杨柳燕，张永春，汤庚国，等. 彩色马蹄莲 mRNA差异显示技术体系的建立[J]. 分子植物育种，2012，11（1）：267-272.
[16]刘怀阿，苏建坤，刘 琴，等.白花马蹄莲诱导胡萝卜软腐果胶杆菌ubiG基因的克隆与功能分析[J].江苏农业学报，2013，29（6）：1304-1312.
[17]张永春，汤庚国，褚云霞，等. 彩色马蹄莲ISSR体系的建立及初步分析[J]. 分子植物育种，2009，7（4）：827-832.
[18]陈 臻，徐秉良，蒲崇建，等. 12C6 重离子辐射下彩色马蹄莲生理生化和抗病性的变化及ISSR多态性分析[J]. 核农学报，2013，27（5）：552-556.
关键词：多倍体；诱导；彩色马蹄莲；RAPD；遗传相似性；聚类分析；抗病育种；分子生物学
中图分类号： S335.21；S682.2 64.03 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2015）03-0142-02
彩色马蹄莲（Zantedeschia hybrida）为天南星科（Araceae）马蹄莲属（Zantedeschia）多年生草本植物，原產于南非[1]。自20世纪80年代末引入我国以来，彩色马蹄莲以其花色绚烂、花形高雅、观花期长而深受消费者的喜爱，因此被称为21世纪的“明星花卉”。彩色马蹄莲在栽培过程中最严重的病害是软腐病[2]，其在引种到我国长江中下游地区后受高温高湿的影响，软腐病病害问题更加突出，培育抗软腐病的彩色马蹄莲品种是解决这一问题的有效途径。但彩色马蹄莲所有品种对该病的抗性均比较弱；而且目前彩色马蹄莲新品种培育方式以杂交育种为主。很显然，这种育种方式很难培育出抗病的彩色马蹄莲品种。所以，研究人员探索采用物理或化学诱变的方式提高彩色马蹄莲的抗病性，从而培育抗病的彩色马蹄莲品种。本试验采用RAPD分子标记技术对彩色马蹄莲品种Parfait（编号为Pr）及其秋水仙素诱导的四倍体（编号为Pr-d）和20、40、60 Gy 60Co γ射线辐射诱变后代（分别编号为Pr-1、Pr-2和Pr-4）分子水平的变异和差异进行研究，为彩色马蹄莲抗病新品种的培育提供分子生物学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
本试验材料为2002年引种自荷兰的彩色马蹄莲品种Parfait，其佛焰苞粉红色（上红下白），叶片盾剑形，上有斑点，引种后在本地的适应性良好。除Parfait外，还有经20、40、60 Gy 60Co γ射线辐射处理的Parfait组培苗及秋水仙素诱导的四倍体Parfait组培苗共5个样品，每个样品组培苗继代次数均在10次以上，随机选取10株，每株分别取样，然后混合，用于提取DNA。
1.2 试验方法
1.2.1 模板DNA的制备与检测
采用北京百泰克生物技术有限公司出品的新型快速植物基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）提取彩色马蹄莲叶片DNA；采用贝克曼库尔特公司生产的DU800紫外/可见光分光光度计测定DNA纯度和含量，并对浓度较高的样品进行稀释，-20 ℃储存，备用。
1.2.2 RAPD-PCR 体系及引物筛选
以提取的彩色马蹄莲Parfait DNA为模板，参照陆波等的方法[3]，对北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司和生工生物工程（上海）股份有限公司合成的40条引物进行多态性筛选，选择条带多态性强、扩增位点多的引物对供试的彩色马蹄莲品种及Parfait辐射诱变处理和多倍体进行RAPD扩增。
1.3 数据分析
每个样品的扩增条带按有（记为1）、无（记为0）进行记录，在Excel表格上生成数据矩阵。计算扩增条带的多态率，用POPGen32软件[4]进行聚类分析。
2 结果与分析
2.1 彩色马蹄莲样品RAPD分子标记结果
利用筛选出来的引物，对彩色马蹄莲 Parfait、Parfait四倍体和辐射诱变后代进行RAPD-PCR，最终筛选出具有特异性条带的引物14个，共获得90个位点，平均每个引物扩增出6.43个位点；其中，多态性位点39个，多态性位点比例为4333%。引物RAPD-47和RAPD-66扩增出的位点最多，均为9个；RAPD-73扩增出的位点最少，仅4个。引物RAPD-66扩增出的多态位点比例最高，为88.89%；有半数引物扩增出的位点全部为共有位点，多态性位点比例为0（表1）。由引物66扩增的RAPD图谱（图1）可见，多倍体诱导和 60Co γ射线辐射使Parfait扩增片段减少，从而表现出多态性。
2.2 彩色马蹄莲Parfait 四倍体及其辐射诱变后代分子水平变异分析
5个陈彩色马蹄莲样品观察到的等位基因数（na）为1402 1个，有效等位基因数（ne）为1.296 5个，Neis基因多样性（h）为0.1666，Shannons多样性指数（I）为0.242 1。
2.3 彩色马蹄莲Parfait多倍体及其辐射诱变与其他品种的亲缘关系的聚类分析
由表2可知，40 Gy 60Co γ射线辐射诱变后代（Pr-2）与四倍体Parfait（Pr-D）遗传相似系数最大，为0.886 6；Parfait与其60 Gy 60Co γ射线辐射诱变后代（Pr-4）间遗传相似系数最小，为0.701 0；所有样品遗传相似系数的平均值0.791 8。
由图2可以看出，5个样品可分为2类，Pr、Pr-2和 Pr-D 聚为一支；Pr-2和Pr-4聚为一支。
3 结论与讨论 自20世纪80年代以来，我国共引入彩色马蹄莲品种40多个。此后，我国研究人员对彩色马蹄莲的快繁技术[5-6]、栽培措施[7-9]、花期调控[10-12]和抗病生理[13-14]等进行了广泛的研究，但关于彩色马蹄莲的分子生物学方面的研究仅有零星的报道[15-17]。在彩色马蹄莲品种间的亲缘关系和多样性分析方面，迄今只有张永春等利用ISSR对10个彩色马蹄莲品种进行鉴定[17]。本试验利用RAPD技术研究多倍体诱导和 60Co γ射线辐射对彩色马蹄莲品种Parfait分子水平遗传变异的影响，结果表明，Parfait、Parfait四倍体及其 60Co γ射线辐射处理多态性条带比率最高为88.89%，平均值为 43.33%，多态性主要表现为多倍体诱导和 60Co γ射线辐射使Parfait的扩增片段减少，但这种多态性远远低于彩色马蹄莲品种间多态性[17]；但与陈臻等基于ISSR标记 12C6 重离子辐射下的彩色马蹄莲多态性十分接近[18]。各样品间的遗传相似系数最大为0.886 6，低于彩色马蹄莲品种间的遗传相似系数[17]，说明多倍体诱导和 60Co γ射线辐射处理致使Parfait分子水平的变异已经达到了品种水平。在对其变异性状及其稳定性进行观测的基础上，培育出彩色马蹄莲新品种是完全可能的。同时，各样品多态性条带比率最高达88.89%，表明通过建立彩色马蹄莲品种分子指纹图谱鉴别彩色马蹄莲品种以解决市场上彩色马蹄莲品种混乱的问题是可行的。
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[8]徐 琼，彭志云. 栽培基质对彩色马蹄莲试管移栽成苗及成球效果的研究[J]. 农业网络信息，2007（5）：215-216，229.
[9]彭 峰，陈嫣嫣，郝日明，等. 彩色马蹄莲组培苗壮苗生根及移栽措施研究[J]. 江苏农业科学，2008（1）：126-128.
[10]黄作喜，吴学尉，段辉国，等. 彩色马蹄莲种球采收处理技术[J]. 内江师范学院学报，2004，19（2）：35-37.
[11]钱妙芬. 马蹄莲花期调控指标探析[J]. 中国生态农业学报，2003，11（4）：32-33.
[12]张璐萍，唐开学，张丽芳. 温度、赤霉素、光照对彩色马蹄莲的花期调控[J]. 种子，2005，24（10）：36-37.
[13]徐 琼，彭志云，徐秉良，等. 栽培措施对彩色马蹄莲细菌性软腐病发生的影响[J]. 植物保护，2008，34（2）：87-89.
[14]王 敏，姬广海，修建华，等. 云南省马蹄莲细菌性软腐病原鉴定[J]. 西南大学学报：自然科学版，2007，29（8）：79-82.
[15]杨柳燕，张永春，汤庚国，等. 彩色马蹄莲 mRNA差异显示技术体系的建立[J]. 分子植物育种，2012，11（1）：267-272.
[16]刘怀阿，苏建坤，刘 琴，等.白花马蹄莲诱导胡萝卜软腐果胶杆菌ubiG基因的克隆与功能分析[J].江苏农业学报，2013，29（6）：1304-1312.
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[18]陈 臻，徐秉良，蒲崇建，等. 12C6 重离子辐射下彩色马蹄莲生理生化和抗病性的变化及ISSR多态性分析[J]. 核农学报，2013，27（5）：552-556.