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【摘 要】 实时荧光定量RT-PCR是在PCR反应体系中加入荧光化学基团，并通过实时荧光定量PCR仪，进行实时、自动检测整个PCR扩增过程中的荧光信号，从而对扩增产物进行实时定量分析的方法。它具有高灵敏、高通量、定量准确、可重复、污染少等优点，被广泛应用于基因诊断，病毒筛选，细胞和组织中RNA的定量等。在采用RT-PCR进行研究的过程中，我们通常需要加入内参基因作为参考，内参基因又称为管家基因，它主要是用来平衡样本之间浓度和纯度的差异，减少实验误差，使得实验结果更加准确，所以内参基因的选择尤为重要。
【关键词】 实时 荧光定量RT-PCR 内参基因
1 理想内参基因的选择
理想的内参基因应该满足以下条件：①不存在假基因（pseudogene）， 以避免基因组 DNA的扩增；②高度或中度表达， 排除太高或低表达；③稳定表达于不同类型的细胞和组织（如正常细胞和癌细胞）， 而且其表达量是近似的，无显著性差别；④表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关；⑤其稳定的表达水平与目标基因相似；⑥不受任何内源性或外源性因素的影响， 如不受任何实验处理措施的影响。排除内参基因的条件则为：①在正常和异常的细胞/组织中的表达存在差异；②呈现细胞周期依赖的表达；③定位于 X染色体[1]。
2 内参基因选择存在的误区
我们做RT-PCR实验时通常存在两个误区，①选择常用的内参基因，没有经过实验进行筛选，如β-actin、18SrRNA、B2M等是我们常选择的内参基因，但有研究表明β-actin 当细胞向恶性转化时，表达量会增加；B2M在软骨细胞、吞噬细胞中均能够稳定表达，但在骨髓间充质干细胞中表达较差[2，3]。②只选择一个内参基因校正数据，而目前没有一种内参基因可以适用于所有的组织和细胞，以及能够满足各种不同的实验条件，如错误的选择一种内参基因，可能导致实验结果的错误，甚至与结论背道而驰，所以选择2个或以上的内参基因有助于发现偏差，以确保结果准确可靠。
3 内参基因的不稳定性
GAPDH和β-actin是常选择的内参基因，但Glare等研究发现在哮喘气道组织中这两个内参基因表达并不稳定，不适合作为内参校正数据[4]。Radonic等证实GAPDH和β-actin这两个内参基因明显地受有丝分裂原刺激的调节，表现出在实验条件下细胞内看家基因的激活[5]。也有研究报道Let-7a在结直肠癌中表达稳定适合作为内参基，，而另有实验证明Let-7a对结直肠癌有抑癌作用，不适合作为内参基因[6，7]。
4 内参基因稳定性分析
由于内参基因在不同实验条件下、不同组织和细胞中表达量不同，甚至差异明显，这为内参基因的选择出了难题。针对这一问题，Jo Vandesompele，Claus 和 Michael等分别编写 geNorm、NormFinder 和 BestKeeper 程序用于进行比较内参基因的表达变化和稳定性评价[8，9]，以便筛选出表达稳定的内参基因，保证实验结果的真实性。
GeNorm程序是Jo Vandesompele于2002年编写的专门用来筛选RT-PCR内参基因的程序，后来该程序得到进一步改进[10]，其核心原理是：无论在何种实验条件下或何种细胞内，两个理想内参基因表达水平的比值应该在所有标本中一致，表达水平不受基因间表达丰度差别和极端比值的影响，比值变异度的增加意味着二者中其一或全部基因表达稳定性的降低。该程序主要通过计算某一基因与其他所有基因间两两比值的对数转换值的平均变异度M作为基因稳定性的评价指标， M 值越小，表示内参基因的表达越稳定，确定最稳定的内参基因，并通过对标准化因子进行配对差异分析来判定所需内参基因的最适数目[11-13]。
NormFinder程序是基于一个固定的统计学框架方差分析，通过测定每个基因的稳定值，根据稳定值的大小排序，最终将表达稳定值最小的基因作为最稳定的基因。但是它的不足之处在于只能选择1个最合适的内参基因[14]。
BestKeeper程序可以分析基因表达稳定性和基因表达水平，它通过把原始数据输入BestKeeper软件的Excel表格中，对内参基因和目标基因进行单独分析。它的优点是不仅可以分析内参基因的稳定性还可以比较目标基因的表达水平，这是GeNorm和NormFinder程序不能达到的。但BestKeeper 程序只能计算一次配对相关系数，当排除某个基因后该程序不能重新计算，这也是其不足之处。
内参基因选择是否正确直接影响着实验结果的准确性，这三种内参基因分析软件分别采用不同的统计学分析方法，从不同方面帮助筛选适合的内参基因，综合三种软件分析的结果，可为正确选择内参基因提供更加可靠的依据。
参考文献
[1] 陈凤花，王琳，胡丽华.实时荧光定量RT-PCR内参基因的选择[J].临床检验杂志，2005，23（5）：393-395.
[2] Farrokhi A，Eslaminejad M B，Nazarian H，et al.Appropriate reference gene selection for real-time PCR data normalization during rat mesenchymal stem cell differentiation[J].Cell Mol Biol （Noisy-le-grand），2012，58 Suppl：L1660-L1670.
[3] Stephens A S，Stephens S R，Morrison N A.Internal control genesfor quantitative RT-PCR expression analysis in mouse osteoblasts， osteoclasts and macrophages[J].BMC Res Notes，2011，4：410. [4] Glare E M.，Divjak M， Bailey M J，et al.b-Actin and GAPDH housekeeping gene expression in asthmatic airways is variable and not suitable for normalising mRNA levels[J].Thorax， 2002， 57：765-770.
[5] Radonic A，Thulke S，Mackay IM，etal.Guideline to reference geneselection for quantitative real-time PCR [J].Biochem Biophys Res Commun，2004，313（4）：856-862.
[6] Monzo M.Navarro A，Bandres E，et al.Owerlapping expression of microRNAs in human embryonic colon and colorectal cancer [J].Cerll Res，2008，18（8）：823-833.
[7] Akao Y.Nakagawa Y.Naoe T.MicroRNAs 143 and 145 are possible common onco-microRNAs in human cancers[J].Oncol Rep.2006.16（4）：845-850.
[8] Claus Lindbjerg Andersen，Jens Ledet Jensen，Torben Falckrntoft.Normalization of Real-Time Quantitative Reverse Transcription-PCR Data：A Model-Based Variance EstimationApproach to Identify Genes Suited for Normalization，Applied to Bladder and Colon Cancer Data Sets[J].CANCER RESEARCH，2004，64（8）： 5245-5250.
[9] Michael W Pfaffl，Ales Tichopad，Christian Prgomet，et al.Determination of stable housekeeping genes，differentially regulated targetgenes and sample integrity：BestKeeper–Excel-based tool using pair-wise correlations[J].Biotechnology Letters，2004，26：509-515.
[10] VandesomPeleJ，DePreterK，PattynFetal.Aeeurate norlnalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal eontrol genes[J].Genomebiology.2002，3（7）：researehO034.
[11] Peltier HJ，Latham GJ.Normalization of microRNA expression levels in quantitative RT-PCR assays：identification of suitable reference RNA targets in normal and cancerous human solid tissues[J].RNA.2008，14（5）：844一852.
[12] Mestdagh P，Van Vlierberghe P，De Weer A et al. A novel and universal method for microRNA RT-qPCR date normalizationg[J].Genome Biol.2009，10（6）：R64.
[13] Vandesompele J，Preter K D，Pattyn F，et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes [J].Genome Biol，2002，3 （7）：research0034.1-0034.11.
[14] Ferreira E， Cronjé MJ （2012）. Selection of suitable reference genes for quantitative real-time PCR in apoptosis-induced MCF-7 breast cancer cells. Mol Biotechnol，50：121-128.
【关键词】 实时 荧光定量RT-PCR 内参基因
1 理想内参基因的选择
理想的内参基因应该满足以下条件：①不存在假基因（pseudogene）， 以避免基因组 DNA的扩增；②高度或中度表达， 排除太高或低表达；③稳定表达于不同类型的细胞和组织（如正常细胞和癌细胞）， 而且其表达量是近似的，无显著性差别；④表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关；⑤其稳定的表达水平与目标基因相似；⑥不受任何内源性或外源性因素的影响， 如不受任何实验处理措施的影响。排除内参基因的条件则为：①在正常和异常的细胞/组织中的表达存在差异；②呈现细胞周期依赖的表达；③定位于 X染色体[1]。
2 内参基因选择存在的误区
我们做RT-PCR实验时通常存在两个误区，①选择常用的内参基因，没有经过实验进行筛选，如β-actin、18SrRNA、B2M等是我们常选择的内参基因，但有研究表明β-actin 当细胞向恶性转化时，表达量会增加；B2M在软骨细胞、吞噬细胞中均能够稳定表达，但在骨髓间充质干细胞中表达较差[2，3]。②只选择一个内参基因校正数据，而目前没有一种内参基因可以适用于所有的组织和细胞，以及能够满足各种不同的实验条件，如错误的选择一种内参基因，可能导致实验结果的错误，甚至与结论背道而驰，所以选择2个或以上的内参基因有助于发现偏差，以确保结果准确可靠。
3 内参基因的不稳定性
GAPDH和β-actin是常选择的内参基因，但Glare等研究发现在哮喘气道组织中这两个内参基因表达并不稳定，不适合作为内参校正数据[4]。Radonic等证实GAPDH和β-actin这两个内参基因明显地受有丝分裂原刺激的调节，表现出在实验条件下细胞内看家基因的激活[5]。也有研究报道Let-7a在结直肠癌中表达稳定适合作为内参基，，而另有实验证明Let-7a对结直肠癌有抑癌作用，不适合作为内参基因[6，7]。
4 内参基因稳定性分析
由于内参基因在不同实验条件下、不同组织和细胞中表达量不同，甚至差异明显，这为内参基因的选择出了难题。针对这一问题，Jo Vandesompele，Claus 和 Michael等分别编写 geNorm、NormFinder 和 BestKeeper 程序用于进行比较内参基因的表达变化和稳定性评价[8，9]，以便筛选出表达稳定的内参基因，保证实验结果的真实性。
GeNorm程序是Jo Vandesompele于2002年编写的专门用来筛选RT-PCR内参基因的程序，后来该程序得到进一步改进[10]，其核心原理是：无论在何种实验条件下或何种细胞内，两个理想内参基因表达水平的比值应该在所有标本中一致，表达水平不受基因间表达丰度差别和极端比值的影响，比值变异度的增加意味着二者中其一或全部基因表达稳定性的降低。该程序主要通过计算某一基因与其他所有基因间两两比值的对数转换值的平均变异度M作为基因稳定性的评价指标， M 值越小，表示内参基因的表达越稳定，确定最稳定的内参基因，并通过对标准化因子进行配对差异分析来判定所需内参基因的最适数目[11-13]。
NormFinder程序是基于一个固定的统计学框架方差分析，通过测定每个基因的稳定值，根据稳定值的大小排序，最终将表达稳定值最小的基因作为最稳定的基因。但是它的不足之处在于只能选择1个最合适的内参基因[14]。
BestKeeper程序可以分析基因表达稳定性和基因表达水平，它通过把原始数据输入BestKeeper软件的Excel表格中，对内参基因和目标基因进行单独分析。它的优点是不仅可以分析内参基因的稳定性还可以比较目标基因的表达水平，这是GeNorm和NormFinder程序不能达到的。但BestKeeper 程序只能计算一次配对相关系数，当排除某个基因后该程序不能重新计算，这也是其不足之处。
内参基因选择是否正确直接影响着实验结果的准确性，这三种内参基因分析软件分别采用不同的统计学分析方法，从不同方面帮助筛选适合的内参基因，综合三种软件分析的结果，可为正确选择内参基因提供更加可靠的依据。
参考文献
[1] 陈凤花，王琳，胡丽华.实时荧光定量RT-PCR内参基因的选择[J].临床检验杂志，2005，23（5）：393-395.
[2] Farrokhi A，Eslaminejad M B，Nazarian H，et al.Appropriate reference gene selection for real-time PCR data normalization during rat mesenchymal stem cell differentiation[J].Cell Mol Biol （Noisy-le-grand），2012，58 Suppl：L1660-L1670.
[3] Stephens A S，Stephens S R，Morrison N A.Internal control genesfor quantitative RT-PCR expression analysis in mouse osteoblasts， osteoclasts and macrophages[J].BMC Res Notes，2011，4：410. [4] Glare E M.，Divjak M， Bailey M J，et al.b-Actin and GAPDH housekeeping gene expression in asthmatic airways is variable and not suitable for normalising mRNA levels[J].Thorax， 2002， 57：765-770.
[5] Radonic A，Thulke S，Mackay IM，etal.Guideline to reference geneselection for quantitative real-time PCR [J].Biochem Biophys Res Commun，2004，313（4）：856-862.
[6] Monzo M.Navarro A，Bandres E，et al.Owerlapping expression of microRNAs in human embryonic colon and colorectal cancer [J].Cerll Res，2008，18（8）：823-833.
[7] Akao Y.Nakagawa Y.Naoe T.MicroRNAs 143 and 145 are possible common onco-microRNAs in human cancers[J].Oncol Rep.2006.16（4）：845-850.
[8] Claus Lindbjerg Andersen，Jens Ledet Jensen，Torben Falckrntoft.Normalization of Real-Time Quantitative Reverse Transcription-PCR Data：A Model-Based Variance EstimationApproach to Identify Genes Suited for Normalization，Applied to Bladder and Colon Cancer Data Sets[J].CANCER RESEARCH，2004，64（8）： 5245-5250.
[9] Michael W Pfaffl，Ales Tichopad，Christian Prgomet，et al.Determination of stable housekeeping genes，differentially regulated targetgenes and sample integrity：BestKeeper–Excel-based tool using pair-wise correlations[J].Biotechnology Letters，2004，26：509-515.
[10] VandesomPeleJ，DePreterK，PattynFetal.Aeeurate norlnalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal eontrol genes[J].Genomebiology.2002，3（7）：researehO034.
[11] Peltier HJ，Latham GJ.Normalization of microRNA expression levels in quantitative RT-PCR assays：identification of suitable reference RNA targets in normal and cancerous human solid tissues[J].RNA.2008，14（5）：844一852.
[12] Mestdagh P，Van Vlierberghe P，De Weer A et al. A novel and universal method for microRNA RT-qPCR date normalizationg[J].Genome Biol.2009，10（6）：R64.
[13] Vandesompele J，Preter K D，Pattyn F，et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes [J].Genome Biol，2002，3 （7）：research0034.1-0034.11.
[14] Ferreira E， Cronjé MJ （2012）. Selection of suitable reference genes for quantitative real-time PCR in apoptosis-induced MCF-7 breast cancer cells. Mol Biotechnol，50：121-128.