目的:整理球药隔重楼的基原及主要混用种,研究其真伪鉴别依据.方法:根据资源调查和分类学鉴定,确定球药隔重楼的主要混用种;通过原植物形态观察、显微特征对比、甾体皂苷化学特征分析、ITS序列聚类分析等4种手段确定物种真实性鉴别特征.结果:亮叶重楼和具柄重楼为球药隔重楼的主要混用种.在形态学特征中,亮叶重楼因叶片光亮,革质,根茎细小而与正品区别,具柄重楼因药隔凸出部分棒状而与正品区别.在粉末显微特征中,球药隔重楼原变种无草酸钙针晶,草酸钙柱晶少见,仅亮叶重楼和具柄重楼淀粉粒脐点明显,且亮叶重楼脐点偏向一端而具柄重楼脐点居中,仅宽瓣球药隔重楼含环纹导管和网纹导管.甾体皂苷成分比较时发现,球药隔组均含重楼皂苷Ⅶ、Ⅵ、H,具柄重楼仅含Ⅶ、H,亮叶重楼均不含.球药隔重楼均符合2015年版中国药典含量标准,具柄重楼和亮叶重楼均不符合.ITS序列的NJ聚类树显示,亮叶重楼和球药隔重楼聚为一支,均与具柄重楼分歧明显.结论:综合原植物形态学特征、粉末显微特征、甾体皂苷化学特征、ITS序列聚类分析等4个层面的证据,可有效区分球药隔重楼及其混用种亮叶重楼和具柄重楼,该鉴别方法可应用于球药隔重楼的规范化种植、药材真伪鉴别和质量控制.